Поляризационная микроскопия является одним из мощных методов морфологических исследования структуры и свойств препаратов. Поляризационная микроскопия позволяет изучать свойства гистологических структур, обладающих способностью двойного лучепреломления.
Для реализации метода поляризационной микроскопии можно дооснастить любой микроскоп. Микроскоп дооснащяется двумя поляризационными фильтрами: первый помещают непосредственно под конденсором, второй помещают между объективом и глазом исследователя. Поворотом поляризатора добиваются затемнения поля зрения. Помещают препарат. Вращают препарат на предметном столике до появления ярко светящихся структур. Свечение появляется в тот момент, когда ось двулучепреломляющего объекта будет находиться под углом 45° к плоскости поляризации.
Ранее для поляризационной микроскопии использовались поляризационные фильтры с линейной поляризацией. В новой методике изучалась возможности диагностики препаратов с использованием поляризационных фильтров с циркулярной поляризацией. Оказалось, что изображения, полученные с помощью циркулярных фильтров, несут гораздо больше информации и позволяют выявлять более тонкую структуру тканей и клеток.
Исследования в поляризованном свете можно проводить на замороженных или парафиновых срезах после депарафинизации, неокрашенных и окрашенных, заключенных в различные среды. Блоки ткани следует вырезать и ориентировать таким образом, чтобы мышечные волокна интересующего слоя миокарда были срезаны продольно.
Миофибриллы в поляризованном свете обнаруживают характерную поперечную исчерченность, связанную с чередованием, анизотропных (А) и изотропных I - дисков. Диски А обладают ярко выраженным положительным двулучепреломлением и кажутся светлыми в поляризованном свете (в обычном свете они темные), тогда как I - диски почти полностью лишены способности к двулучепреломлению и в поляризованном свете выглядят темными (в обычном свете - светлые).
С помощью поляризационной микроскопии удобно выявлять наиболее универсальные повреждения мышечных волокон миокарда и скелетных мышц - контрактурные повреждения (нарушение поперечной исчерченности кардиомиоцитов - одно из ранних признаков повреждения миофибрилл).
Принято выделять 3 стадии этих повреждений:
I стадия - усиливается анизотропия на отдельных участках мышечных волокон. II
стадия - А-диски с повышенной анизотропией сближаются, вследствие чего толщина 1-дисков уменьшается. III
стадия - А-диски сливаются в сплошной анизотропный конгломерат.
Наряду с контрактурными повреждениями поляризационная микроскопия
позволяет идентифицировать еще один тип поражения поперечнополосатых мышечных волокон - гиперрелаксацию саркомеров, свойственную в большой мере ишемии миокарда .
Простота поляризационного метода позволяет с минимальными затратами резко повысить достоверность диагностики наличия инфаркта миокарда.
По поводу поляризационного микроскопа. Ситуация состоит в том, что практически из любого микроскопа можно сделать поляризационный. Используются два поляризационных фильтра (покупаемых в фотомагазине) - один помещается над осветителем, а второй помещается между препаратом и объективом.
Создан справочный CD-ROM - «Поляризационная микроскопия». На диске собрано большое количество работ и материалов по применению поляризационной микроскопии.
Кроме того, создан специализированный комплекс - автоматизированное рабочее место судмедэксперта. В состав комплекса входят - микроскоп поляризационный Nikon E200, цифровая камера с 8 млн элементов, адаптеры и программное обеспечение.
Список литературы: 1.
Кактурский Л.В. Поляризационная микроскопия. В кн. Микроскопическая техника. - М.: Медицина, 1996. 2.
Целлариус Ю.Г., Семенова Л.А. Применение поляризационной микроскопии для гистологической диагностики ранних стадий ишемических и метаболических повреждений миокарда // Cor et vasa. - 1977 - Vol. 19. - № 1. - P. 28-33 3.
Непомнящих Л.М. Морфогенез важнейших общепатологических процессов в сердце. - Новосибирск: Наука, 1991. - 352 с. 4.
Целлариус Ю.Г., Семенова Л.А., Непомнящих Л.М. Очаговые повреждения и инфаркт миокарда. Световая, поляризационная и электронная микроскопия. - Новосибирск, 1980.
Еще по теме Колтовой Н.А. НОВЫЙ МЕТОД ПОЛЯРИЗАЦИОННОЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФАРКТА МИОКАРДА:
- ВОПРОС 252: Какие недостатки в профессиональной деятельности медицинских работников могут стать поводом для возбуждения уголовного или гражданского дела?
- Кирилов В.А., Бахметьев В.И. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОРФОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИДА ВНЕШНЕГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ПО МОРФОЛОГИЧЕСКИМ ПРИЗНАКАМ РАЗРУШЕНИЯ ДЛИННЫХ ТРУБЧАТЫХ КОСТЕЙ
- Мишин Е.С., Подпоринова Е.Э., Праводелова А.О. ОЦЕНКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ПОДЪЯЗЫЧНОЙ КОСТИ, ГОРТАНИ И ТРАХЕИ ПРИ ТУПОЙ ТРАВМЕ ШЕИ
Предположим, у вас есть пара сломанных поляризационных стёкол (поляризаторов). Если вы возьмёте одно стекло и повернёте его по отношению к другому, вы получите темноту. Степень непрозрачности зависит от качества поляризаторов.
Подавление 95-98 % света - превосходный показатель; если он намного меньше, появляется грязно-серый оттенок, Взаимное положение поляризаторов при получении тёмного поля называется скрещенным, при получении наиболее светлого ноля - параллельным.
Перед тем как обратиться к поляризационной микроскопии, давайте вернёмся к упомянутому выше патологу.
Добавим в его светлопольный или фазовоконтрастный микроскоп между бинокулярной насадкой и корпусом микроскопа устройство, которое позволит вводить поляризационный элемент (анализатор) в оптический путь. Поместим другой поляризационный элемент (поляризатор) под конденсор и будем поворачивать его до получения полной темноты (анализатор и поляризатор скрещены); зафиксируем при этом их положение. Вставим в это устройство (между бинокулярной насадкой и корпусом микроскопа) выдвижной держатель с компенсатором - красной пластинкой первого порядка. Допустим, патолог исследует препарат ткани и замечает объект, похожий на кристалл. Он устанавливает анализатор, поляризатор поворачивает до скрещенного положения и рассматривает объект. Если это кристалл или кристаллическое образование, то оно светится, как если бы за полупрозрачным экраном был включён осветитель. Пока ещё патолог не может определить, кристалл ли это мочевой кислоты или кальция. Он вводит в ход лучей красную пластинку первого порядка и поворачивает её из одного установленного положения в другое: кристалл становится или красным, или зелёным. Таким образом можно определить природу кристалла. Затем патолог убирает из оптического пути анализатор и, при желании, поляризатор и продолжает работу (изучаемая область препарата остаётся в поле зрения).
Теперь обратим внимание на поляризационный микроскоп. Он включает многие компоненты, которые присутствуют в обычном светлопольном микроскопе, поскольку предполагает исследование препарата в светлом иоле между поляризующими элементами.
Довольно часто, особенно при обучении студентов, используют монокулярные поляризационные микроскопы по причине их низкой стоимости. Профессора предпочитают бинокулярные модели. В бинокулярной насадке может быть установлена либо фиксированная, либо с возможностью фокусировки линза Бертрана, необходимая для исследования
(её функции описаны ниже). Между насадкой и корпусом находится деталь, в которой располагается анализатор, и прорезь для установки компенсатора.
Микроскоп имеет круглый и вращаемый предметный столик, что позволяет рассматривать препарат, поворачивая его между скрещенными анализатором и поляризатором. Столик также оборудован шкалой для измерения его поворота в градусах и угловых минутах. Под предметным столиком (обычно под конденсором) находится поворачиваемый поляризатор с фиксацией его положения под 0, 45° и 90° к положению анализатора. Разумеется, в микроскоп установлена апертурная диафрагма и, как правило, держатель светофильтров.
В окуляре моно- или бинокулярной насадки есть перекрестие. Все центрирование проводится относительно этого перекрестия, препарат также поворачивается вокруг центра этого перекрестия.
Отличие механического предметного столика в том, что он должен быть низко расположен, чтобы при повороте об него не ударялись объективы. Очень часто это измерительный столик, который при перемещении в направлении восток - запад или север - юг последовательно фиксируется через заданные промежутки. Представьте себе шарик, который попадает в бороздку, - так работает механизм фиксации. Можно взять предмет острее шарика - эффект будет тот же. Когда вы поворачиваете объективы, механизм фиксации удерживает каждый объектив в оптическом ходе лучей.
Для подсчёта различных компонентов на тонком срезе им на счётчике присваивают номера от 1 до 9. Номер 10 предназначен для выбросов или суммирования. Исследователь перемещает препарат до фиксации столика и смотрит, находится ли один из 9 компонентов на перекрестии. Если там нет ни одного из них, то выбирают номер 10. При подсчёте материала на счётчике нужно указать число каждого из компонентов и всего остального на номере 10. После просмотра всего препарата можно рассчитать процентное содержание любого из 9 компонентов материала.
Компенсатор устанавливается в микроскопе под углом 45° к направлениям север - юг и восток - запад.
Большинство компонентов видны одинаково вне зависимости от того, как они расположены по отношению к компенсатору, но некоторые требуют поворота, и это ещё одна причина, по которой столик должен быть вращаемым. Мы не будем углубляться в описание функций различных компенсаторов или клиньев, так как вы можете приобрести специальную книгу по этому вопросу. Мы лишь упомянем некоторые названия: пластина в 1/4 длины волны - кварцевый клин, который может иметь 6, 30 или 120 порядков; красная пластинка первого порядка (у неё есть три других названия, позволяющие определить возраст тех, кто их использует: пластина замедления света, чувствительная тоновая пластинка и гипсовая пластина, самая старая).
Рассмотрим понятие «порядок». Когда свет преломляется через призму, становятся видны все цвета спектра, затем они становятся все бледнее (третий, четвёртый и т. д. наборы цветов-порядков). Нулевой порядок - это чёрный свет в самом начале спектра. Красная пластинка первого порядка, как и следует из названия, эквивалентна красному в первом порядке цветов.
Линза Бертрана в комбинации с окуляром даёт вспомогательную визирную трубку, позволяющую рассматривать интерференционные фигуры в выходном зрачке микрообъектива в то время, когда сам микроскоп сфокусирован на определённое зерно препарата. Если геологу необходимо идентифицировать материал, он поворачивает тонкий срез минерала между скрещенными поляризатором и анализатором. При этом видны 2 цвета (и только 2), а для превращения одного цвета в другой нужен специфический угол поворота препарата. Таким образом можно идентифицировать большинство минералов. Однако некоторые минералы так схожи по параметрам цвета и углам поворота, что интерференционная картина - единственный способ их идентифицировать.
Петрография изучает геологию нефти. У петрографического микроскопа нет линзы Бертрана, поскольку его пользователям интерференционная картина не нужна.
Стандартная геологическая работа выполняется на тонком шлифе. Он представляет собой тонкий срез камня, отшлифованный, заключенный в эпоксидной смоле на предметное стекло размером 1x2 дюйма и затем отшлифованный ещё раз для того, чтобы толщина шлифа не превышала 15 микронов; после этого препарат устанавливают на предметный столик и накрывают покровным стеклом. Такие препараты наблюдают в свете, идущем от поляризатора через тонкий шлиф.
Все подобные исследования относятся к светлопольному микроскопу, к которому добавляются поляризатор, анализатор и компенсатор.
Исследователь руды может начать подготовку образца так же, как и тонкого среза, сделав его толщиной в 6-10 мм и отшлифовав поверхность. Ему потребуется эпиосвещение, следовательно, между бинокулярной насадкой и корпусом микроскопа должен быть помещен осветитель. Там будет и лампочка, и трансформатор; поляризатор, анализатор, компенсатор; апертурная и полевая диафрагмы, дихроичное зеркало ит. д.
Работа объективов для поляризационного света отличается от работы стандартных объективов. Главное, они должны быть свободны от внутреннего натяжения. Натяжение в объективах возникает в результате давления металлических оправ на края линзы. При наблюдении через микроскоп это проявляется во вспышке белого света, идущего от точки давления по направлению к центру.
Производители тщательно проверяют объективы на наличие внутреннего натяжения. Те объективы, в которых нет натяжения, идут в комплект поляризационных микроскопов по высокой цене; а объективы с натяжением, идут в комплект биологических микроскопов, в которых натяжение не играет никакой роли, или вовсе бракуются.
Мы продемонстрировали вам необходимость наших объективов. Эти объективы предназначены и скоррегированы для работы с препаратами под покровными стёклами толщиной 0,17 мм.
При исследовании руды под микроскопом полированную поверхность не закрывают покровным стеклом. Для такой работы есть нам нужны объективы, которые не будут скорректированы относительно покровных стёкол, или объективы для металлографии, но без натяжения.
Объективы 10х могут работать как с покровными стёклами, так и без них. Для рудных микроскопов потребуются 20х и более сильные объективы, которые скоррегированы на отсутствие покровного стекла.
Наш стандартный поляризационный микроскоп обычно имеет в комплекте объективы 5х, 10х и 40х. Револьвер имеет 4 гнезда для объективов, поэтому мы добавили второй объектив 40х для препаратов без покровного стекла, получив таким образом, двойной световой поляризационный микроскоп. Ранее при описании окуляров Гюйгенса, в примечании, было сказано, что они не обеспечивают цветокоррекцию или компенсацию хроматической аберрации и для решения этой проблемы следует обратиться к разделу «Поляризационная микроскопия».
С того момента, как мы определились со значением цветов, мы не хотим, чтобы окуляр или объектив давали в поле зрения цвета, не принадлежащие препарату. Мы знаем, что объективы без натяжения были выбраны для поляризационных микроскопов, из-за отсутствия натяжения и цветовой коррекции. Следовательно, очень важно, чтобы и окуляры были без цветовой коррекции или компенсации. По этой причине поляризационные окуляры обычно модифицированы до окуляров Гюйгенса. Иногда применяются также широкопольные окуляры, но специально проверенные на соответствие поляризационному микроскопу.
Будьте внимательны при подсчёте общего увеличения поляризационного микроскопа. Из-за высоты устройства, служащего для крепления анализатора и компенсатора, появляется дополнительное увеличение бинокулярной насадки. Например, микроскоп, снабжённый револьвером на 3 объектива, имеет дополнительное увеличение 1,4х, а микроскоп с револьвером на 4 объектива - 1,8х.
На рис. 10 приведен общий вид поляризационного микроскопа.
1. 10-кратный широкопольный окуляр с большим выносом зрачка
2. Линза Бертрана
3. Прорезь для компенсатора
4. Микрообъективы без натяжения
5. Вращаемый предметный столик со шкалой на лимбе; цена деления 1°
6. Конденсор
7. Вращаемый поляризатор с возможностью вывода из хода лучей
8. Полевая ирисовая диафрагма
9. Фокусировочный 10-кратный окуляр с направляющей и перекрестием
10. Бинокулярная насадка с возможностью поворота на 360° и с углом наклона 30° к оптической оси
11. Винт крепления бинокулярной насадки
12. Держатель анализатора
13. Револьвер с микрообъективами
14. Штатив микроскопа
15. Клипсы препаратодержателя
16. Регулятор перемещения по высоте кронштейна конденсора
17. Коаксиально расположенные механизмы грубой и точной фокусировки
18. Основание микроскопа со встроенным трансформатором и регулировкой яркости галогеновой лампы 6 В, 30 Вт.
Гистологическое исследование - это исследование тканей под микроскопом. А цитологическое исследование отличается от гистологического тем, что при нём проводится не исследование ткани, а исследование клеток.
Виды микроскопии
Методы световой микроскопии
Методы световой микроскопии (освещения и наблюдения). Методы микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов, так как последние, как отмечалось выше, влияют на контрастность изображения.
Метод светлого поля и его разновидности
Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д.
Метод темного поля и его разновидности
Используют специальный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры не окрашенного материала. При этом лучи от осветителя падают на препарат под косым углом, и объект исследования проявляется освещенным в темном поле..
Метод фазового контраста
При прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении света через неокрашенные — фаза световой волны, что и используют для получения высоко контрастного изображения.
Поляризационная микроскопия
Поляризационная микроскопия позволяет изучать ультраструктурную организацию тканевых компонентов на основе анализа анизотропии и/или двойного лучепреломления
Метод интерференционного контраста
Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой - мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом). Величина этого запаздывания измеряется компенсатором
Метод исследования в свете люминесценции
Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами.
Ультрафиолетовая микроскопия . Основана на применении ультрафиолетовых лучей с длиной волны менее 380 нм, что позволяет увеличить разрешающую способность объективов с 0,2…0,3 мкм до 0,11 мкм. Требует применения специальных ультрафиолетовых микроскопов, в которых используются ультрафиолетовые осветители, кварцевая оптика и преобразователи ультрафиолетовых лучей в видимую часть спектра. Многие вещества, входящие в состав клеток (например, нуклеиновые кислоты), избирательно поглощают ультрафиолетовые лучи, что используется для определения количества этих веществ в клетке.
Трансмиссионная микроскопия . В трансмиссионных микроскопах электроны проходят через образец. Энергия электронов сравнительно невелика (до 50 кВ); при этом происходит их рассеивание и поглощение. Для создания контрастного изображения применяются особые методы подготовки материала.
Сканирующие электронные микроскопы основаны на сканировании образца. При этом точно сфокусированный пучок электронов пробегает по поверхности образца, а отраженные электроны формируют изображение, подобное трехмерному. Разрешающая способность сканирующего микроскопа меньше, чем у трансмиссионного (5…20 нм).
Высоковольтные электронные микроскопы основаны на использовании электронов сверхвысоких энергий (до 1 МВ – одного миллиона вольт). Столь мощные пучки пробивают относительно толстые срезы (до 5 мкм), что позволяет использовать этот тип микроскопии для изучения целостных клеток.
Метод замораживания – скалывания.
Клетки замораживают при температуре жидкого азота (196 О С) в присутствии криопротектора и используют для изготовления сколов. Плоскости скола проходят через гидрофобную середину двойного слоя липидов. Обнажённую внутреннюю поверхность мембран оттеняют платиной, полученные реплики изучают в сканирующем ЭМ. Затем, обычно в вакуумной камере, избыток льда удаляют возгонкой. Эта операция называется травлением. После травления более резко обозначается рельеф в плоскости скола. Полученный образец оттеняется, то есть на поверхность образца напыляется тонкий слой тяжелых металлов.
Культура тканей, микрургия.
Метод культуры клеток и тканей
заключается в выращивании клеток и тканей вне организма в искусственных питательных средах. Метод позволяет изучать реакции клеток на различные воздействия, механизмы регуляции пролиферации, дифференцировки и гибели.
Микрургия (micrurgia; микр + ergon - работа, действие) - совокупность методических приемов и технических средств для осуществления операций на очень мелких объектах: одноклеточных организмах, отдельных клетках многоклеточных, внутриклеточных структурах.
Клеточная инженерия, понятие о гетерокарионе, гибридизация.
Гетерокарион — соматическая клетка, образованная в результате слияния родительских клеток с гаплоидными генетически различными ядрами. Образовавшиеся гетерокарионы дают начало двум одноядерным гибридным клеткам.
В 1965 году английский ученый Г. Харрис впервые получил гетерокарионы, образованные клетками мыши и человека.
Гибридизация- процесс образования или получения гибридов , в основе которого лежит объединение генетического материала разных клеток в одной клетке
Е. Темнопольная микроскопия.
18. Микроскоп состоит из оптических и механических частей. Что относят к оптическим частям?
А. Тубус, окуляр, конденсор
В. Револьвер, макро- и микровинт, зеркало
С. Револьвер, окуляр
Д. Окуляр, конденсор, объектив
Е. Тубус, окуляр, револьвер
19. При использовании ультрафиолетовых лучей, как источник света, разрешающая способность микроскопа увеличивается. В каких микроскопических приборах используется данный источник света?
А. Темнопольный и люминесцентный
В.Люминесцентный, ультрафиолетовый
С. Световой и электронный
Д.Фазово-контрастный, ультрафиолетовый
Е.Поляризационный, ультрафиолетовый
20. Микроскоп состоит из механических и оптических частей. В каких деталях микроскопа есть диафрагма?
А. Окуляр и объектив
В. Окуляр и конденсор
С. Тубус и окуляр
Д. Объектив и конденсор
Е. Тубус, объектив, окуляр
21. В эксперименте использовались живые объекты, в которых необходимо определить ряд химических компонентов, используя витальное наблюдение. Какой микроскопический метод исследования будет использован?
А. Фазово-контрастная микроскопия
В. Электронная микроскопия
С. Флюоресцентная микроскопия
Е Темнопольная микроскопия.
22. При гистологическом исследовании клетки использовали люминофоры. Какой вид микроскопии использован в данном случае?
А. Световая микроскопия
В. Электронная микроскопия
С. Флюоресцентная микроскопия
Д. Поляризационная микроскопия
Е. Темнопольная микроскопия.
23. Перед исследователем поставлена задача получить пространственное представление о структурах изучаемого объекта. С каким микроскопическим прибором будет работать специалист?
А. Ультрафиолетовая микроскопия,
В. Фазово-контрастная микроскопия,
С. Просвечивающая электронная микроскопия,
Д. Сканирующая электронная микроскопия,
Е. Поляризационная микроскопия
24. В качестве источника света используются ртутно-кварцевые лампы. Какова разрешающая способность микроскопа при таком источнике света?
25. Разрешающая способность микроскопа зависит от длины волны источника света. Какова разрешающая способность светового микроскопа?
26. Перед началом исследования гистологического препарата необходимо равномерно осветить поле зрения. Какие части микроскопа для этого используют?
А. Микро- и макровит
В. Конденсор и зеркало
С. Тубус и тубусодержатель
Д. Тубус и окуляр
27. Перед исследователем поставлена задача изучить ультра-микроскопическое строение плазмолеммы эритроцита. Какой микроскопический прибор будет использован?
А. Световой
В. Фазово-контрастный
С. Электронный
Д. Поляризационный
Е. Ультрафиолетовый
28. При изучении скелетной мышечной ткани необходимо определить изо- и анизотропные структуры ткани. Какой вид микроскопии будет использован?
А. Световой
В. Фазово-контрастный
С. Электронный
Д. Поляризационный
Е. Ультрамикроскопический
29. Разрешающая способность люминесцентного микроскопа зависит от длины волны источника света. Чему она равна?
А. 0,1 мкм С. 0,4 мкм
В. 0,2 мкм Д. 0,1 нм
30. В клинической лаборатории для изучения общего анализа крови используются микроскопические исследования. Какой микроскоп необходим для этого?
А. Световой,
В. Фазово-контрастный,
С. Электронный,
Д. Поляризационный,
Е. Ультрафиолетовый.
31. Для исследования представлен живой объект, обладающий природной люминесценцией. Какой вид микроскопии необходимо использовать при данном исследовании?
А. Световой
В. Фазово-контрастный
С. Электронный
Д. Поляризационный
Е. Ультрафиолетовый
32. В результате биопсии получен материал опухолевых клеток. Необходимо изучить их ультрамикроскопическое строение. Какой вид микроскопии используют при данном исследовании?
А. Световой
В. Фазово-контрастный
С. Электронный
Д. Поляризационный
Е. Ультрафиолетовый
ТЕМА 2: ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА
Основные принципы приготовления препаратов для световой и электронной микроскопии, взятие материала (биопсия, игловая пункционная биопсия, аутопсия). Фиксация, обезвоживание, уплотнение объектов, приготовление срезов на микротомах и ультрамикротомах. Виды мипрепаратов - срез, мазок, отпечаток, пленки, шлиф. Окрашивание и контрастирование препаратов. Понятие о гистологических красителях.
Микроскопическая техника.
Главные этапы цитологического и гистологического анализа:
Выбор объекта исследования
Подготовка его для изучения в микроскопе
Применение методов микроскопирования
Качественный и количественный анализ полученных изображений
Методы, применяемые в гистологической технике:
1. Прижизненные.
2. Посмертные.
I ПРИЖИЗНЕННЫЕ МЕТОДЫ
Целью прижизненных исследований является получение информации о жизнедеятельности клетки: движение, деление, рост, дифференцировка, взаимодействие клеток, продолжительность жизни, разрушение, реактивные изменения под действием различных факторов.
Исследование живых клеток и тканей возможно вне организма (in vitro) или внутри организма (in vivo).
А. Исследование живых клеток и тканей в культуре (in vitro) –
Метод культивирования
Различают: а)суспензионные культуры (клетки, взвешенные в питательной среде), б)тканевые, в)органные, г)монослойные.
Метод культивирования ткани вне организма является самым распространенным. Культивировать ткань можно в специальных прозрачных герметически закрытых камерах. В стерильных условиях в камеру помещают каплю питательной среды. Наилучшей питательной средой является плазма крови, к которой добавляют эмбриональный экстракт (вытяжка из тканей зародыша, содержащая большое количество веществ, стимулирующих рост). Туда же помещают кусочек органа или ткани (не более 1 мм3), которые необходимо культивировать.
Выдерживать культивируемую ткань следует при температуре тела организма, ткань которого взята для исследования. Так как питательная среда быстро приходит в негодность (в ней накапливаются продукты распада, выделяемые культивируемой тканью), то каждые 3-5 дней ее нужно менять.
Использование метода культивирования позволило выявить ряд закономерностей дифференцировки, злокачественного перерождения клеток, взаимодействий клеток между собой, а также с вирусами и микробами. Культивирование эмбриональных тканей позволило изучить развитие кости, хряща, кожи и др.
Особую значимость метод культивирования имеет для проведения экспериментальных наблюдений на клетках и тканях человека, в частности для определения пола, злокачественного перерождения, наследственных заболеваний и др.
Недостатки метода:
1. Главным недостатком этого метода является то, что ткань либо орган исследуется в отрыве от организма. Не испытывая нейрогуморального влияния организма, она теряет присущую ей дифференцировку.
2. Необходимость частых пересадок (при длительном культивировании).
3. Одинаковый коэффициент лучепреломления тканей.
Похожая информация.
Оглавление темы "Методы выделения бактерий. Микроскопия. Питательные среды для культивирования бактерий.":
Поляризационная микроскопия позволяет получать изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновых волокон, миофибрилл или клеток микроорганизмов). Принцип метода основан на изучении объекта в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях.
Рис. 11-4. Схема люминесцентного микроскопа .Интерференционная микроскопия
Интерференционная микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии. Метод применяют для получения контрастного трёхмерного изображения неокрашенных объектов. Принцип метода основан на раздвоении светового потока в микроскопе; один луч проходит через объект, другой - мимо него. Оба луча соединяются в окуляре и интерферируют между собой.
Рис. 11-5. Прямая иммунофлюоресценция
. Прямой метод предполагает использование помеченных флюоресцирующим красителем AT к интересующему Аг; AT взаимодействуют с Аг в местах их локализации, что и позволяет визуализировать метка.
Люминесцентная микроскопия
Метод люминесцентной микроскопии основан на способности некоторых веществ светиться при воздействии коротковолнового излучения. При этом испускаемые световые волны длиннее волны, вызывающей свечение. Иными словами, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра (рис. 11-4). Например, если индуцирующее излучение синее, то образующееся свечение может быть красным или жёлтым. Эти вещества (флюоресцеин изоцианат, акридиновый оранжевый, родамин и др.) используют как флюоресцирующие красители для наблюдения флюоресцирующих (люминес-цирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от источника (ртутная лампа сверхвысокого давления) проходит через два фильтра.
Рис. 11-6. Непрямая иммунофлюоресценция
. Непрямой метод предполагает использование двух различных AT. Первые AT реагируют с Аг микроорганизма, вторые AT (связанные с меткой) специфически взаимодействуют с первыми AT, являющимися Аг ко вторым AT. Метод значительно чувствительнее, чем прямая иммунофлюоресценция, так как с каждой молекулой первых AT связывается несколько молекул вторых AT.
Первый (синий) фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Второй (жёлтый) задерживает синий свет, но пропускает жёлтый, красный, зелёный свет, излучаемый флюоресцирующим объектом и воспринимаемый глазом. Обычно исследуемые микроорганизмы окрашивают непосредственно либо с помощью AT или лектинов, помеченных флюоро-хромами. Препараты взаимодействуют с Аг или другими связывающими лиганд структурами объекта. Люминесцентная микроскопия нашла широкое применение для визуализации результатов иммунохимических реакций, основанных на специфическом взаимодействии меченных флюоресцирующими красителями AT с Аг изучаемого объекта. Варианты иммунофлюоресцентных реакций представлены на рис. 11-5 и 11-6.