Зависимость скорости реакции от концентрации фермента и концентрации субстрата (кинетика ферментативных реакций) представлена на графиках.
график 1 график 2
В ферментативной реакции (F+S 2 ó 1 FS→ 3 F + P) выделяют скорости трёх составляющих этапов:
1- образование фермент-субстратного комплекса FS,
2- обратный распад фермент – субстратного комплекса,
3 – распад фермент-субстратного комплекса с образованием продуктов реакции. Скорость каждой из этих реакций подчиняется закону действующих масс:
V 1 = К 1 [F]* [S]
V 2 = K 2 *
В момент равновесия скорость реакции образования FS равна сумме скоростей его распада: V 1 = V 2 +V 3 . Из трёх этапов ферментативной реакции наиболее важным и медленным является третий, так как он связан с образованием продуктов реакции. По приведенной выше формуле найти скорость V 3 невозможно, так как фермент- субстратный комплекс очень неустойчив измерение его концентрациизатруднено. В связи с этим, Михаэлис-Ментен ввели Кm – константу Михаэлиса и преобразовали уравнение для измерения V 3 в новое уравнение, в котором присутствуют реально измеримые величины:
V 3 = K 3 * * [S] / Km +[S] или V 3 =V max * [S] / Km+[S]
– исходная концентрация фермента
Кm – константа Михаэлиса.
Физический смысл Кm: Кm = (К 2 +К 3) /К 1 . Она показывает соотношение констант скоростей распада фермент-субстратного комплекса и константы скорости его образования.
Уравнение Михаэлиса-Ментен является универсальным. Оно иллюстрирует зависимость скорости реакции от от [S]
1. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата.
Эта зависимость выявляется при малых концентрациях субстрата [S]
2. Зависимость скорости от концентрации фермента проявляется при высокой концентрации субстрата. S≥Km. В этом случае можно пренебречь Km и уравнение преобразуется в следующее: V 3 = K 3* (( * [S]) /[S]) =K 3* = V max . Таким образом, при высокой концентрации субстрата скорость реакции определяется концентрацией фермента и достигает максимального значения V 3 = K 3 =V max . (третий участок графика 2).
3. Позволяет определить численное значение Km при условии V 3 = V max /2. В этом случае уравнение приобретает вид:
V max /2 = ((V max *[S])/Km+[S]), откуда следует, что Km=[S]
Таким образом, Кm численно равна концентрации субстрата при скорости реакции, равной половине максимальной. Кm является очень важной характеристикой фермента, она измеряется в молях (10 -2 – 10 -6 моль) и характеризуют специфичность фермента: чем ниже Km, тем выше специфичность фермента.
Графическое определение константы Михаэлиса.
Удобнее использовать график, представляющий прямую линию. Такой график предложен Лайнуивером – Берком (график двойных обратных величин), который соответствует обратному уравнению Михаэлиса - Ментен
§ 12. КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ
Кинетика ферментативных реакций – наука о скоростях ферментативных реакций, их зависимости от различных факторов. Скорость ферментативной реакции определяется химическим количеством прореагировавшего субстрата или образовавшегося продукта реакции в единицу времени в единице объема при определенных условиях:
где v – скорость ферментативной реакции, – изменение концентрации субстрата или продукта реакции, t – время.
Скорость ферментативной реакции зависит от природы фермента, которая определяет его активность. Чем выше активность фермента, тем выше скорость реакции. Активность фермента определяют по скорости реакции, катализируемой ферментом. Мерой активности фермента является одна стандартная единица активности фермента. Одна стандартная единица активности фермента – это такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 минуту.
В процессе ферментативной реакции фермент (Е) взаимодействует с субстратом (S), в результате образуется фермент-субстратный комплекс, который затем распадается с высвобождением фермента и продукта (Р) реакции:
Скорость ферментативной реакции зависит от многих факторов: от концентрации субстрата и фермента, температуры, рН среды, наличия различных регуляторных веществ, способных увеличивать или снижать активность ферментов.
Интересно знать! Ферменты используются в медицине для диагностики различных заболеваний. При инфаркте миокарда вследствие повреждения и распада сердечной мышцы в крови резко возрастает содержание ферментов аспартаттрансаминазы и аланинаминотрансферазы. Выявление их активности позволяет диагностировать данное заболевание.
Влияние концентрации субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции
Рассмотрим влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции (рис. 30.). При низких концентрациях субстрата скорость прямо пропорциональна его концентрации, далее с ростом концентрации скорость реакции увеличивается медленнее, а при очень высоких концентрациях субстрата скорость практически не зависит от его концентрации и достигает своего максимального значения (V max). При таких концентрациях субстрата все молекулы фермента находятся в составе фермент-субстратного комплекса, и достигается полное насыщение активных центров фермента, именно поэтому скорость реакции в этом случае практически не зависит от концентрации субстрата.
Рис. 30. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата
График зависимости активности фермента от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса – Ментен, которое получило свое название в честь выдающихся ученых Л.Михаэлиса и М.Ментен, внесших большой вклад в исследование кинетики ферментативных реакций,
где v – скорость ферментативной реакции; [S] – концентрация субстрата; K M – константа Михаэлиса.
Рассмотрим физический смысл константы Михаэлиса. При условии, что v = ½ V max , получаем K M = [S]. Таким образом, константа Михаэлиса равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной.
Скорость ферментативной реакции зависит и от концентрации фермента (рис. 31). Эта зависимость носит прямолинейный характер.
Рис. 31. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента
Влияние температуры на скорость ферментативной реакции
Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры представлена на рис. 32.
Рис. 32. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.
При низких температурах (приблизительно до 40 – 50 о С) повышение температуры на каждые 10 о С в соответствии с правилом Вант-Гоффа сопровождается увеличением скорости химической реакции в 2 – 4 раза. При высоких температурах более 55 – 60 о С активность фермента резко снижается из-за его тепловой денатурации, и, как следствие этого, наблюдается резкое снижение скорости ферментативной реакции. Максимальная активность ферментов наблюдается обычно в пределах 40 – 60 о С. Температура, при которой активность фермента максимальна, называется температурным оптимумом. Температурный оптимум ферментов термофильных микроорганизмов находится в области более высоких температур.
Влияние рН на скорость ферментативной реакции
График зависимости ферментативной активности от рН представлен на рис. 33.
Рис. 33. Влияние рН на скорость ферментативной реакции
График зависимости от рН имеет колоколообразную форму. Значение рН, при котором активность фермента максимальна, называется рН-оптимумом фермента. Значения рН-оптимума для различных ферментов колеблются в широких пределах.
Характер зависимости ферментативной реакции от рН определяется тем, что этот показатель оказывает влияние на:
a) ионизацию аминокислотных остатков, участвующих в катализе,
b) ионизацию субстрата,
c) конформацию фермента и его активного центра.
Ингибирование ферментов
Скорость ферментативной реакции может быть снижена действием ряда химических веществ, называемых ингибиторами . Некоторые ингибиторы являются для человека ядами, например, цианиды, другие – используются в качестве лекарственных препаратов.
Ингибиторы можно разделить на два основных типа: необратимые и обратимые . Необратимые ингибиторы (I) связываются с ферментом с образованием комплекса, диссоциация которого с восстановлением активности фермента невозможна:
Примером необратимого ингибитора является диизопропилфторфосфат (ДФФ). ДФФ ингибирует фермент ацетилхолинэстеразу, играющего важную роль в передаче нервного импульса. Этот ингибитор взаимодействует с серином активного центра фермента, блокируя тем самым активность последнего. Вследствие этого нарушается способность отростков нервных клеток нейронов проводить нервный импульс. ДФФ является одним из первых веществ нервно-паралитического действия. На его основе создан ряд относительно нетоксичных для человека и животных инсектицидов - веществ, ядовитых для насекомых.
Обратимые ингибиторы, в отличие от необратимых, при определенных условиях могут быть легко отделены от фермента. Активность последнего при этом восстанавливается:
Среди обратимых ингибиторов выделяют конкурентные и неконкурентные ингибиторы.
Конкурентный ингибитор, являясь структурным аналогом субстрата, взаимодействует с активным центром фермента и таким образом перекрывает доступ субстрата к ферменту. При этом ингибитор не подвергается химическим превращениям и связывается с ферментом обратимо. После диссоциации комплекса EI фермент может связаться либо с субстратом и преобразовать его, либо с ингибитором (рис. 34.). Поскольку и субстрат и ингибитор конкурируют за место в активном центре, такое ингибирование называется конкурентным.
Рис. 34. Механизм действия конкурентного ингибитора.
Конкурентные ингибиторы используются в медицине. Для борьбы с инфекционными болезнями ранее широко применялись сульфаниламидные препараты. Они близки по своей структуре к пара-аминобензойной кислоте (ПАБК), необходимому фактору роста многих патогенных бактерий. ПАБК является предшественником фолиевой кислоты, которая служит кофактором ряда ферментов. Сульфаниламидные препараты выступают в качестве конкурентного ингибитора ферментов синтеза фолиевой кислоты из ПАБК и тем самым подавляют рост и размножение патогенных бактерий.
Неконкурентные ингибиторы по структуре не сходны с субстратом и при образовании EI взаимодействуют не с активным центром, а с другим участком фермента. Взаимодействие ингибитора с ферментом приводит к изменению структуры последнего. Образование EI-комплекса является обратимым, поэтому после его распада фермент вновь способен атаковать субстрат (рис. 35).
Рис. 35. Механизм действия неконкурентного ингибитора
В качестве неконкурентного ингибитора может выступать цианид CN - . Он связывается с ионами металлов, входящими в состав простетических групп и подавляет активность этих ферментов. Отравления цианидами крайне опасны. Они могут привести к летальному исходу.
Аллостерические ферменты
Термин «аллостерический» происходит от греческих слов allo – другой, stereo – участок. Таким образом, аллостерические ферменты наряду с активным центром имеют другой центр, называемый аллостерический центр (рис. 36). С аллостерическим центром связываются вещества, способные изменять активность ферментов, эти вещества называют аллостерическими эффекторами . Эффекторы бывают положительными – активирующими фермент, и отрицательными – ингибирующими, т.е. снижающими активность фермента. Некоторые аллостерические ферменты могут подвергаться действию двух и более эффекторов.
Рис. 36. Структура аллостерического фермента.
Регуляция мультиферментных систем
Некоторые ферменты действуют согласованно, объединяясь в мультиферментные системы, в которых каждый фермент катализирует определенную стадию метаболитического пути:
В мультиферментной системе есть фермент, который определяет скорость всей последовательности реакций. Этот фермент, как правило, бывает аллостерическим и находится в начале матаболитического пути. Он способен, получая различные сигналы, как повышать, так и понижать скорость катализируемой реакции, тем самым регулируя скорость всего процесса.
КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ
Vфр определяется количеством вещества, которое превращается в единицу времени. V этих реакций зависит от влияния внешних факторов (температура, рН, воздействие природных и чужеродных соединений и т.д.).
Vфр является мерой каталитической активности и обозначается просто как активность ферментов.
Измерить активность ферментов можно только косвенно:
1) по количеству превращаемого S;
2) нарастанию концентрации Р в единицу времени.
Для выражения концентрации фермента пользуются:
а) единица измерения ферментов – это то количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля S в мин. [мкмоль/мин];
б) 1 катал (кат) – количество ферментов, способное вызывать превращение 1 моля S в Р в 1 сек. [моль/с].
1 кат = 6×107Е; 1Е = 16,67 (н кат)
Для выражения активности ферментов пользуются:
а) удельная активность ферментов – это число ферментов на 1 мг или число кат. на 1 кг белка;
б) молекулярная активность или число оборотов – это число молекул S, подвергающихся превращению одной молекулой Е в 1 мин.
Одна молекула каталазы эритроцитов расщепляет в 1 мин 5×106 молекул Н2О2.
Специфичность действия ферментов
Понятие Е S комплекса и АЦФ тесно взаимосвязаны с особым свойством ферментов – их специфичностью. По степени специфичности (в порядке ее снижения) различают:
I. Стереохимическую субстратную специфичность – в этом случае ферменты катализируют только 1 форму S (1 изомер). Например, фумаратгидратаза катализирует только превращение фумаровой кислоты, но не катализирует превращение ее изомера – малеиновую кислоту.
II. Абсолютную субстратную специфичность – Е превращает только 1S. Например, уреаза превращает только мочевину.
III. Абсолютная групповая S-ную специфичность. Ферменты действуют на группу сходных S-в. Например, алкоголь ДГ превращает не только этанол, но и другие алифатические спирты.
IV. Относительную групповую S-ную специфичность. Фермент воздействует не на группу молекул S, а на определенные связи определенных групп S-в. Например, пепсин и трипсин специфичны по отношению к пептидным связям в различных белках.
V. Относительную S-ную специфичность. Фермент катализирует, превращаясь в S-в, относящимся к различным группам химических соединений. Например, фермент цитохром-450 катализирует реакции гидроксилирования до 7000 разных S-в. Это наименее специфичная ферментная система.
Существует две теории объяснения специфичности ферментов.
Гипотеза Э. Фишера – гипотеза «ключа и замка» или гипотеза «шаблона». По Фишеру, фермент – это жесткая структура, АЦФ которого - точный «слепок» S-та. Если S подходит к Е как ключ к замку, то реакция произойдет. Если же S немного изменен («ключ»), то он не соответствует АЦФ («замку»), и реакция становится невозможной. Несмотря на логичность такого объяснения, гипотеза Фишера не объясняет, на чем тогда основаны абсолютная и относительная групповая специфичность. Например, цитохром-450 соединяется с таким большим количеством S-в, различных по строению.
Эти внешние противоречия объясняет гипотеза Кошленда, или гипотеза вынужденного соответствия. По мнению Кошленда, молекула фермента не «жесткая», а гибкая структура и конфигурация фермента и его АЦФ начинают изменяться в момент присоединения фермента к S или другим лигандам. При образовании Е-S комплекса кроме геометрической комплементарности имеет место и электростатическая, которая осуществляется благодаря спариванию противоположно заряженных молекул Е и S. В действительности, видимо, имеют место оба варианта присоединения.
Гипотеза Кошленда позволяет объяснить, почему происходит превращение близких аналогов S-в. Если «ложный» субстрат (квази-S) отличается от природного и АЦФ принимает конформацию близкую к истинному субстрату, то расстановка каталитических групп в таком Е-S комплексе позволит осуществить реакцию. Этот «обман» фермент как бы не замечает, хотя реакция идет и не так быстро, как с истинным субстратом. Если конфигурация квази субстрата не позволяет правильно расположиться каталитической группе, то в этом случае реакция не пойдет. Т.е. если диапазон конформационных перестроек ограничен до одной единственно возможной, то фермент высокоспецифичен, а если возможности перестройки АЦФ велики, то фермент срабатывает и на квази субстраты.
Зависимость Vфр от рН-среды
Для каждого фермента имеется свой оптимум рН, при котором Vфр максимальна. Отклонение рН в ту или другую сторону ведет к снижению активности фермента. Большая часть ферментов имеет рН~7,0 то есть он совпадает с физиологическими значениями рН.
При оптимальном значении рН функциональные группы АЦФ и сам S находятся в наиболее предпочтительной для связи форме. Некоторые ферменты имеют оптимальную рН, резко отличающиеся от физиологических значений, пепсин на 100% активен при рН = 1,5-2,5; аргиназа – при рН = 10.
Зависимость Vфр от температуры
С повышением температуры среды Vфр увеличивается, достигает оптимальных величин ~ 20-40ºС для большинства ферментов.
Термолабильность ферментов связана с их белковым строением: при повышении температуры до 40-50ºС и выше, происходит их денатурация.
Для некоторых ферментов денатурации наступает при 0ºС.
Для любых химических реакций при повышении температуры на каждые 10ºС V реакции увеличивается в 2-3 раза, для ферментативных реакций этот коэффициент ниже – 2 и даже меньше. Исключение: термостабильный фермент адениматциклаза выдерживает температуру 100ºС, а фермент каталаза активен при 0ºС.
Зависимость Vфр от конц. S.
Механизм действия ферментов описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Установить зависимость Vфр от [S] можно графически.
а) по кривой Михаэлиса: чем меньше Km, тем больше Vm и тем выше сродство E к S.
Vmax соответствует состоянию полного насыщения фермента S-том.
в растворе избыток Е (3 мол S, 5 мол Е) это участок насыщения фермента S-том.
б) методом обратных величин Лайнцивера-Берка, где зависимостьVфр от [S] рассчитывают в обратных величинах.
Регуляция активности ферментов.
Ферменты являются катализаторами с регулируемой активностью, поэтому через ферменты можно контролировать Vфр. Регуляция активности может осуществляться путем взаимодействия ферментов с различными биологическими компонентами или же чужеродными соединениями (лекарствами, ядами), которые называются модификаторами. Если в присутствии модификатора Vфр возрастает, то такие модификаторы называют активаторами, а если падает ингибиторами.
Активирование ферментов.
Существует несколько видов активации ферментов.
1. Активирование путем воздействия на субъединицы молекул фермента. Некоторые ферменты имеют ЧС в виде 2-х субъединиц: каталитической и регуляторной. При сохранении ЧС АЦФ скрыт.
Например, многие ферменты в организме вырабатываются в виде проферментов или зимогенов, то есть в неактивном состоянии. По мере необходимости определенное их количество активируется. Например, неактивный трипсиноген под действием фермента энтерокиназы превращается в активный трипсин.
2. На активирование ферментов влияют ионы:
а) катионы – их воздействие более специфично, чем анионов. Катионы могут сами выступать в виде простетических групп в ферментах (Fe в цитохроме) или своим присутствием воздействовать на фермент, активируя его. Например, угольная ангидраза активируется в присутствии Zn+2.
б) анионы – действуют менее специфично и обычно виляют на 2-й этап ф.р. – распад ES-комплекса. Однако иногда и анионы являются непосредственными активаторами ферментов. Например, Cl– активирует неактивный пепсиноген и превращает его в активный пепсин.
3. Активация путем защиты ферментов от инактивирующего влияния различных воздействий. Обеспечивается специфическими веществами, предупреждающими отрицательное влияние на ферменты.
Ингибирование ферментов.
Вещества, вызывающие частичное или полное торможение ферментов называются ингибиторами(I). Ингибиторы обладают свойством прочно связываться с ферментом. По этому признаку различают ингибирование: обратимое и необратимое.
При обратимом ингибировании I и Е вступают во взаимодействием. Если каким-нибудь образом ингибитор нейтрализовать (например, диализом), то активность Е восстанавливается. Если этого не удается достигнуть, то речь идет о необратимом ингибировании.
Обратимое ингибирование
конкурентное неконкурентное
Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами со структурой, сходной со структурой истинного S.
I и S конкурируют за АЦФ, комплекс с ферментом образует то соединение, молекул которого больше. С ферментом связывается либо I, либо S, для такого ингибирования справедливо уравнение: .
НИКОГДА при конкурентном ингибировании не образуется тройной комплекс E S I, чем этот вид ингибирования отличается от других.
Например, сукцинат ДГ входит в состав ферм. системы ЦТК. Его природный S – сукцинат. Ингибиторами могут быть оксалоацетат, малонат (квази-субстраты).
При избытке ингибитор связывается поляризованными группами с АЦФ сукцинат ДГ.
При конкурентном ингибировании Vmax никогда не меняется, но меняется Km. Наклон кривых в присутствии I увеличивается, в результате Km увеличивается
По результатам эксперимента по кривой Михаэлиса-Ментен можно установить конкурентную природу I (по увеличению Km и стабильности Vmax). Характер этой кривой свидетельствует и об обратимости процесса, то есть увеличивая [S], можно сократить время достижения Vmax.
Метод конкурентного ингибирования нашел широкое применение в медицинской практике.
Пара-аминобензойная кислота и сульфаниламид имеют сходную структуру. п-АБК-ту бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, являющейся составляющей частью ферментов бактерий. С/а блокирует действие ферментов, синтезирующих фолиевую кислоту, в результате рост бактерий останавливается.
Неконкурентное ингибирование – это обратимое торможение, когда I взаимодействует не с АЦФ, а с другими функциональными группами ферментов, то есть в данном случае I не имеет структурного сходства с S. Присоединение такого ингибитора снижает активность фермента, а не его сродство к S, то есть ингибитор не изменяет Km, а снижает макс. Vфр.
При этом виде ингибирования образуется неактивные малодиссоциирующие комплексы E I или E I S. Например, действие HCN, других химических соединений, связывающих ионы Ме или других функциональных групп в молекуле фермента.
Смешанное ингибирование (или частично неконкурентный тип) - снижение Vmax сочетается с увеличением Km.
При этом образуется Е I S-комплекс, а S в нем подвергается медленному каталитическому превращению.
Субстратное ингибирование – это снижение Vфр при значительном повышении [S]. Первоначально, с увеличением [S] Vфр растет, достигая своего максимума, но при дальнейшем увеличении [S] Vфр начинает падать.
Механизм ингибирующего действия избытка S разнообразен. Чаще всего это взаимодействие промежуточных соединений E S с еще одной иди несколькими молекулами S, в результате чего образуется неактивное соединение, то
есть комплекс, не дающий продуктов реакции.
Методы регуляции активности ферментов
В живом организме одновременно происходят реакции синтеза, распада и взаимопревращений тысяч разнообразных веществ. Все эти множества реакций регулируются в организме посредством различных механизмов, наиболее важными из которых являются:
а) регуляция по типу обратной связи; характерна обычно для реакций синтеза. Накопление продуктов реакции свыше допустимого уровня оказывает сильное ингибирующее действие на первую стадию процесса:
б) аллостерическая регуляция активности ферментов – характерна только для особой группы ферментов с ЧС, имеющих регуляторные центры для связывания аллостерических эффекторов. Отрицательные эффекторы тормозят превращение S и выступают в роли аллостерических ингибиторов. Положительные эффекторы, напротив, ускоряют Vфр, поэтому их относят к к аллостерическим активаторам.
Механизм действия аллостерических ингибиторов на фермент заключается в изменении АЦФ этого фермента. Уменьшение Vфр является либо следствием увеличения Km, либо результатом уменьшенияVmax, при тех же насыщающих концентрациях S. Аллостерические активаторы напротив облегчают превращение S в АЦФ, что сопровождается либо уменьшением Km, либо увеличением Vmax.
Компартментализация – явление, при котором с помощью мембран пространственно разъединяется
а) фермент от своих S (например, лизомальные ферменты от веществ, на которые они действуют в цитоплазме);
б) взаимно несовместимые в одно и тоже время процессы. Синтез жк происходит в растворимой части цитоплазмы, а распад жк – в митохондриях.
Общие принципы кинетики химических реакций применимы и к ферментативным реакциям. На основании большого числа экспериментальных исследований было установлено, что зависимость скорости ферментативного процесса от концентрации субстрата в общем виде можно представить кривой, изображенной на рис. 5.5.
Рис. 5.5. Общий вид зависимости стационарной скорости протекания ферментативной реакции (v CT) от концентрации субстрата ([S]) при постоянной концентрации фермента:
а - реакция первого порядка (при [S] Км скорость реакции пропорциональна концентрации субстрата); б - реакция смешанного порядка; в - реакция нулевого порядка, когда v ct ~ v max и скорость реакции не зависит от концентрации субстрата
При низкой концентрации субстрата зависимость стационарной скорости реакции от концентрации субстрата (см. рис. 5.5, участок а) близка к линейной и подчиняется кинетике реакций первого порядка, т. е. скорость реакции S -* Р прямо пропорциональна концентрации субстрата S и в любой момент времени t определяется следующим кинетическим уравнением: где [S] - молярная концентрация субстрата S; - d[S]/d/ - скорость убыли субстрата; к константа скорости реакции, которая в данном случае имеет размерность, обратную единице времени. При высокой концентрации субстрата (участок в) скорость реакции максимальна, постоянна и не зависит от концентрации субстрата [S]. В этих условиях реакция подчиняется кинетике реакций нулевого порядка v = к" и целиком определяется концентрацией фермента.
В данном случае проявляется важная особенность ферментативных реакций - явление насыщения фермента субстратом. На участке б скорость реакции пропорциональна произведению концентраций двух реагирующих веществ (субстрата и фермента), т. е. реакция протекает по законам реакции второго порядка. Из приведенной на рис. 5.5 зависимости видно, что изменение концентрации субстрата в области низких значений существенно влияет на скорость процесса, а при высоких концентрациях субстрата это влияние очень мало или практически отсутствует. При низких концентрациях субстрата скорость реакции контролируется двумя факторами: собственно скоростью катализируемой ферментом реакции и частотой столкновения фермента с субстратом. По мере увеличения концентрации субстрата частота столкновений перестает быть фактором, определяющим скорость реакции.
Уравнения кинетики последовательных реакций (5.5), (5.8), (5.9) справедливы и для кинетики ферментативных реакций, тщательное изучение которых показало, что общий вид кинетических кривых расходования субстрата S имеет 5-образный вид, типичный для реакций последовательного превращения (рис. 5.6).
Рис. 5.6.
I - начальный участок (период индукции), который длится менее долей секунды и занимает незначительную часть общего времени протекания реакции. Здесь скорость меняется от нулевой до v CT ; II - стационарный участок. На этом участке скорость остается примерно постоянной в течение нескольких минут; III - основной участок, на который приходится большая часть времени протекания реакции; здесь скорость монотонно падает
Такой вид кривой расходования субстрата по модели, предложенной Михаэлисом и Ментен, объясняется образованием промежуточного комплекса в ферментативном процессе: в ходе ферментативной реакции субстрат S образует с молекулой фермента Е соединение - фермент-субстратный комплекс ES, распадающийся по двум направлениям. При распаде по первому пути вновь образуется исходная молекула субстрата S и фермента Е. При распаде по другому пути образуется молекула продукта Р и регенерируется молекула фермента. Таким образом, механизм ферментативного процесса (ферментативного катализа) описывается как последовательная реакция фермент + субстрат фермент-субстратный комплекс -» продукт + фермент, в которой фермент Е связывается с субстратом S в обратимой реакции (константы скоростей к, к 2) с образованием фермент-субстратного комплекса ES. Последний распадается в реакции с константой скорости Аз на фермент Е и продукт Р:
Экспериментальные доказательства рассмотренного механизма действия ферментов впервые получили Л. Михаэлис и М. Ментен (1913), принявшие, что промежуточный фермент-субстратный комплекс ES обратимо образуется согласно закону действия масс:
Они полагали, что скорость распада ES с образованием продукта Р мала по сравнению со скоростью установления равновесия, определяемого к и к 2 . На основании данных предположений было выведено уравнение, названное в честь авторов уравнением Михаэлиса-Ментен, выражающее количественное соотношение между концентрацией субстрата и стационарной скоростью ферментативной реакции:
где v max - максимальная скорость реакции при больших концентрациях субстрата (см. рис. 5.6), а К м
- константа Михаэлиса,
представляющая собой константу диссоциации фермент-субстратного комплекса на фермент и исходный субстрат.
. В
модели предполагается, что продукт не может обратно превращаться в субстрат (что справедливо для ранних стадий реакции, когда концентрация продукта низкая). Поскольку на начальной стадии реакции концентрация Р мала, то и вероятность обратной реакции продукта с ферментом бесконечно мала, и тогда к }
определяет скорость всего процесса. В этом случае скорость ферментативной реакции v CT определяется как
,
что и подтверждает наличие прямолинейного начального участка на рис. 5.6.
В дальнейшем данная модель была развита с учетом того, что концентрация фермент-субстратного комплекса ES может уменьшаться с заметной скоростью.
В уравнении Михаэлиса-Ментен (5.12) величины v max , К м постоянны для данного фермента, хотя могут меняться независимо друг от друга при различных условиях.
Если [S]« К м, то
и реакция подчиняется уравнению первого порядка.
При [S] » К м
Это означает, что реакция не зависит от концентрации субстрата и протекает по уравнению нулевого порядка.
При К м = [S] , г ст = Vmax/2, т. е. К м численно равна концентрации субстрата [S], при которой скорость реакции составляет половину максимальной величины. Это равенство может использоваться для определения константы Михаэлиса-Ментен.
Уравнение Михаэлиса-Ментен (5.12) можно преобразовать аналогично преобразованиям Гендерсона-Гассельбаха для диссоциации слабых электролитов:
или
Рис. 5.7.
На рис. 5.7 показана кинетическая кривая ферментативной реакции, построенная по уравнению Михаэлиса-Ментен, представляющая собой гиперболическую зависимость стационарных скоростей катализируемой ферментом реакции от концентрации субстрата.
Для графического определения К м уравнение (5.12) может быть преобразовано следующим образом:
из которого следует линейная зависимость 1/v от 1/[S].
Подобное преобразование первыми предложили Г. Лайнуивер и Д. Бэрк, поэтому уравнение (5.13) и график (рис. 5.8) носят их имена. Тангенс угла наклона прямой на рис. 5.8 равен соотношению
Рис. 5.8.
К м /v max , величина, отсекаемая на оси 1/v, соответствует значению
Если на графике (см. рис. 5.8) провести линию до пересечения с осью 1/[S], то в точке 1/v = О 1/[S] - -1/*м-
Таким образом, при экспериментальном определении скорости процесса минимум при двух различных концентрациях субстрата можно получить константу К м.
Свойства ферментов
1. Зависимость скорости реакции от температуры
Зависимость активности ферментов (скорости реакции) от температуры описывается колоколообразной кривой с максимумом скорости при значениях оптимальной температуры для данного фермента . Повышение скорости реакции при приближении к оптимальной температуре объясняется увеличением кинетической энергии реагирующих молекул.
Зависимость скорости реакции от температуры
Закон о повышении скорости реакции в 2-4 раза при повышении температуры на 10°С справедлив и для ферментативных реакций, но только в пределах до 55-60°С, т.е. до температур денатурации белков. При понижении температуры активность ферментов понижается, но не исчезает совсем.
Как исключение, имеются ферменты некоторых микроорганизмов, существующих в воде горячих источников и гейзеров, у них оптимум температуры приближается к точке кипения воды. Примером слабой активности при низкой температуре может служить зимняя спячка некоторых животных (суслики, ежи), температура тела которых понижается до 3-5°С. Это свойство ферментов также используется в хирургической практике при проведении операций на грудной полости, когда больного подвергают охлаждению до 22°С.
Ферменты могут быть очень чувствительны к изменению температуры:
- у сиамских кошек мордочка, кончики ушей, хвоста, лапок черного цвета. В этих областях температура всего на 0,5°С ниже, чем в центральных областях тела. Но это позволяет работать ферменту, образующему пигмент в волосяных луковицах, при малейшем повышении температуры фермент инактивируется,
- обратный случай - при понижении температуры окружающего воздуха у зайца-беляка пигментообразующий фермент инактивируется и заяц получает белую шубку,
- противовирусный белок интерферон начинает синтезироваться в клетках только при достижении температуры тела 38°С,
Бывают и уникальные ситуации:
- для большинства людей повышение температуры тела на 5°С (до 42°С) несовместимо с жизнью из-за дисбаланса скорости ферментативных реакций. В то же время у некоторых спортсменов обнаружено, что при марафонском беге их температура тела составила около 40°С, максимальная зарегистрированная температура тела была 44°С.
2. Зависимость скорости реакции от рН
Зависимость также описывается колоколообразной кривой с максимумом скорости при оптимальном для данного фермента значении рН.
Данная особенность ферментов имеет существенное значение для организма в его адаптации к изменяющимся внешним и внутренним условиям. Сдвиги величины рН вне- и внутри клетки играет роль в патогенезе заболеваний, изменяя активность ферментов разных метаболических путей.
Для каждого фермента существует определенный узкий интервал рН среды, который является оптимальным для проявления его высшей активности. Например, оптимальные значения рН для пепсина 1,5-2,5, трипсина 8,0-8,5, амилазы слюны 7,2, аргиназы 9,7, кислой фосфатазы 4,5-5,0, сукцинатдегидрогеназы 9,0.
Зависимость скорости реакции от величины pH
Зависимость активности от кислотности среды объясняется наличием аминокислот в структуре фермента, заряд которых изменяется при сдвиге рН (глутамат, аспартат, лизин, аргинин, гистидин). Изменение заряда радикалов этих аминокислот приводит к изменению их ионного взаимодействия при формировании третичной структуры белка, изменению его заряда и появлению другой конфигурации активного центра и, следовательно, субстрат связывается или не связывается с активным центром.
Изменение активности ферментов при сдвиге рН может нести и адаптивные функции. Так, например, в печени ферменты глюконеогенеза требуют меньшей рН, чем ферменты гликолиза , что удачно сочетается с закислением жидкостей организма при голодании или физической нагрузке.
Для большинства людей сдвиги величины рН крови за пределы 6,8-7,8 (при норме 7,35-7,45) несовместимы с жизнью из-за дисбаланса скорости ферментативных реакций. В то же время у некоторых марафонцев обнаружено снижение рН крови в конце дистанции до 6,8-7,0. И ведь при этом они сохраняли работоспособность!
3. Зависимость от количества фермента
При увеличении количества молекул фермента скорость реакции возрастает непрерывно и прямо пропорционально количеству фермента, т.к. большее количество молекул фермента производит большее число молекул продукта.