Множество открытий прошедшего века обязаны русскому ученому Михаилу Цвету и его методу хроматографического анализа. Большое число выдающихся исследователей обязано ему своими успехами, а многие и Нобелевскими премиями!

"...Без работ Майкла Цвета нам, всем "пигментщикам", делать было бы нечего..." - вот мнение одного известного английского ученого.

Михаил Семенович Цвет (1872–1919) - сын итальянки и русского интеллигента. Он родился в Италии в городе Асти, неподалеку от Турина. В 1891 году Михаил окончил Женевскую гимназию и поступил на физико-математический факультет Женевского университета. Представив диссертацию "Исследование физиологии клетки. Материалы к познанию движения протоплазмы, плазматических мембран и хлоропластов" Цвет в октябре 1896 года получил диплом доктора естественных наук. В декабре того же года он приезжает в Петербург.

Михаил не знал, что ученая степень Женевского университета не признается в России. Поэтому ему пришлось работать у известного ботаника Андрея Сергеевича Фаминцина, также изучавшего хлорофилл, можно сказать, на птичьих правах. В Петербурге Цвет познакомился с другими выдающимися ботаниками и физиологами растений: И.П. Бородиным, М.С. Ворониным, А.Н. Бекетовым. Это было блестящее общество оригинальных, богатых идеями мыслителей и умелых экспериментаторов. Цвет продолжил свои исследования хлоропластов, готовясь в то же время к новым магистерским экзаменам и к защите диссертации. Экзамены он сдал в 1899 году, а магистерскую диссертацию он защитил в Казанском университете 23 сентября 1901 года.

С ноября 1901 года Цвет работает на должности ассистента кафедры анатомии и физиологии растений в Варшавском университете. На XI Съезде естествоиспытателей и врачей Михаил Семенович сделал доклад "Методы и задачи физиологического исследования хлорофилла", в котором впервые сообщил о методе адсорбционной хроматографии.

Михаил Семенович долгое время решал задачу разделения пигментов зеленого листа, а они очень близки по свойствам. К тому же в листьях присутствуют и другие, очень яркие, пигменты - каротиноиды. Именно благодаря каротиноидам и по осени появляются желтые, оранжевые, багровые листья. Однако пока хлорофиллы не разрушатся, отделить их от каротиноидов было почти невозможно.

Как замечает Ю.Г. Чирков, "видимо, открытие Цвета явилось реакцией на существующие тогда грубые и убийственные для пигментов методы их разделения. Вот один из приемов.

Сначала добывали спиртовую вытяжку хлорофилла, затем ее три часа кипя гили с добавлением в раствор крепкой щелочи (едкого калия). В результате хлорофилл разлагается на составные части - зеленый и желтый пигменты.

Но ведь в процессе изготовления этого зелья (почти алхимические манипуляции) природный хлорофилл мог разрушиться. И тогда исследователь имел бы дело с кусками пигментов, а то и с продуктами их химического превращения".

О том, как свершилось великое открытие, пишет С.Э. Шноль: "Он взял стеклянную трубку, наполнил ее порошком мела и на верхний слой налил немного спиртового экстракта листьев Экстракт был буро-зеленого цвета, и такого же цвета стал верхний слой меловой колонки. А затем М.С. начал по каплям лить сверху в трубку с мелом чистый спирт. Капля за каплей очередная порция растворителя элюировала пигменты с крупинок мела, которые перемещались вниз по трубке. Там свежие крупинки мела адсорбировали пигменты и в свою очередь отдавали их новым порциям растворителя. В силу несколько разной прочности адсорбции (легкости элюции) увлекаемые подвижным растворителем разные пигменты двигались по меловой колонке с разной скоростью и образовывали однородные окрашенные полосы чистых веществ в столбике мела. Это было прекрасно. Ярко-зеленая полоса, полоса чуть желтее зеленого - это два вида хлорофиллов - и яркая желто-оранжевая полоса каротиноидов. М.С. назвал эту картину хроматограммой".

"Цвет показал, - пишет Чирков, - что при пропускании растворенных в жидкости растительных пигментов через слой бесцветного пористого сорбента отдельные пигменты располагаются в виде окрашенных зон - каждый пигмент имеет собственный цвет или хотя бы оттенок. Порошок сорбента (это может быть мел, сахарная пудра...) адсорбирует (поверхностно поглощает: латинское adsorbere значит "глотать") разные пигменты с неодинаковой силой: одни могут "проскочить" с током раствора дальше, другие окажутся задержанными ближе. Полученный таким образом послойно окрашенный столбик сорбента Цвет назвал хроматограммой, а метод - хроматографией".

Так была решена казавшаяся неразрешимой задача. Метод оказался гениально прост. Он совсем не похож на громоздкие, требовавшие большого числа реактивов сложные процедуры, применяемые до этого.

Может, эта простота стала причиной того, что большая часть современников или не восприняла это удивительное открытие, или, что еще печальнее, резко восстала против его автора.

Но время все расставило на свои места. Цвет изобрел хроматографию для исследований хлорофилла. Он впервые выделил вещество, которое назвал хлорофиллом альфа и хлорофиллом бета. Он оказался пригодным для исследований не только пигментов, но и бесцветных, неокрашенных смесей - белков, углеводов. К шестидесятым годам двадцатого века хроматографии было посвящено уже несколько тысяч исследований. Хроматография стала универсальным методом.

"...Принцип хроматографического разделения веществ, открытый М. Цветом, лежит в основе множества разнообразных методов хроматографического анализа. Без его использования было бы невозможно большинство достижений в науке и технике XX века...

В основе всего этого - одна общая идея. Она проста. Это, в сущности, идея геометрической прогрессии. Пусть имеются два вещества очень близкие по всем своим свойствам. Ни осаждением, ни экстракцией, ни адсорбцией не удается разделить их в заметной степени. Пусть одно вещество адсорбируется на поверхности, например, карбоната кальция (т. е. менее 1 процента).

Иными словами, его содержание на адсорбенте составит 0,99 от содержания другого. Обработаем адсорбент каким-либо растворителем так, чтобы произошли десорбция (отсоединение) и элюция (смывание) обоих веществ и оба они перешли бы с адсорбента в растворитель, и перенесем этот получившийся раствор на свежую порцию адсорбента. Тогда доля первого вещества на поверхности адсорбента снова будет равна 0,99 от содержания второго, т. е. адсорбируется часть, равная 0,99 х 0,99=0,98 от исходного количества. Еще раз проведем элюцию и снова адсорбцию - теперь доля первого вещества составит 0,98 х 0,99 = 0,97 от содержания второго. Чтобы содержание первого вещества на очередной порции адсорбента составило всего 1 процент от содержания второго, потребуется повторить цикл адсорбции-элюции около 200 раз...

Идея многократной переадсорбции для разделения веществ может быть модифицирована в многократное перераспределение смеси веществ в системе несмешивающихся растворителей. Это - основа распределительной хроматографии. Та же идея лежит в основе современных методов электрофореза, когда смесь веществ движется с разной скоростью по различным адсорбентам в электрическом поле.

Хроматография– это метод разделения и определения веществ,основанный на распределении компонентов между двумя фазами –подвижной и неподвижной. Неподвижной (стационарной) фазой служит твердое пористое вещество (часто его называют сорбентом) или пленка жидкости, нанесенная на твердое вещество. Подвижная фаза представляет собой жидкость или газ, протекающий через неподвижную фазу, иногда под давлением. Компоненты анализируемой смеси (сорбаты) вместе с подвижной фазой передвигаются вдоль стационарной фазы. Ее обычно помещают в стеклянную или металлическую трубку, называемую колонкой. В зависимости от силы взаимодействия с поверхностью сорбента (за счет адсорбции или по какому-либо другому механизму) компоненты будут перемещаться вдоль колонки с разной скоростью. Одни компоненты останутся в верхнем слое сорбента, другие, в меньшей степени взаимодействующие с сорбентом, окажутся в нижней части колонки, а некоторые и вовсе покинут колонку вместе с подвижной фазой (такие компоненты называются неудерживаемыми, а время их удерживания определяет “мертвое время” колонки).

Таким образом происходит быстрое разделение сложных смесей компонентов.

История открытие:

Рождение хроматографии

Вечером этого дня на заседании биологического отделения Варшавского Общества естествоиспытателей выступил ассистент кафедры анатомии и физиологии растений Михаил Семёнович Цвет с докладом «О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биохимическому анализу».

К сожалению, М.С.Цвет, будучи по образованию ботаником, не оценил в должной мере химический аналитический аспект своего открытия и мало публиковал свои работы в химических журналах. Впоследствии именно химики оценили реальный масштаб предложенного М.С. Цветом хроматографического метода, который стал наиболее распространенным методом аналитической химии.

Следует подчеркнуть следующие достоинcтва хроматографических методов:

1. Разделение носит динамический характер, причем акты сорбции- десорбции разделяемых компонентов повторяются многократно. Этим обусловлена значительно большая эффективность хроматографического

разделения по сравнению со статическими методами сорбции и

экстракции.

2. При разделении используют различные типы взаимодействия сорбатов и неподвижной фазы: от чисто физических до хемосорбционных.

Это обуславливает возможность селективного разделения широкого круга

3. На разделяемые вещества можно накладывать различные дополнительные поля (гравитационное, электрическое, магнитное и др.), которые, изменяя условия разделения, расширяют возможности хроматографии.

4. Хроматография – гибридный метод, сочетающий одновременное разделение и определения нескольких компонентов.

5. Хроматография позволяет решать как аналитические задачи (разделение, идентификация, определение), так и препаративные (очистка, выделение, концентрирование). Решение этих задач можно сочетать, выполняя их в режиме “online”.

Многочисленные методы классифицируются по агрегатному состоянию фаз, механизму разделения и технике проведения разделения.

Хроматографические методы различаются и по способу проведения

процесса разделения на фронтальный, вытеснительный и элюентный.

Ионная хроматография

Ионная хроматография– это высокоэффективная жидкостная хроматография для разделения катионов и анионов на ионообменниках

низкой емкости. Широкое распространение ионной хроматографии

обусловлено рядом ее достоинств:

– возможность определять большое число неорганических и

органических ионов, а также одновременно определять катионы и

– высокая чувствительность определения(до1 нг/мл без

предварительного концентрирования;

– высокая селективность и экспрессность;

– малый объем анализируемой пробы(не более2 мл образца);

– широкий диапазон определяемых концентраций(от1 нг/мл до

– возможность использования различных детекторов и их комбинаций, что позволяет обеспечить селективность и малое время определения;

– возможность полной автоматизации определения;

– во многих случаях полное отсутствие предварительной пробоподготовки.

Вместе с тем, как и любой аналитический метод, ионная хроматография не лишена недостатков, к которым можно отнести:

– сложность синтеза ионообменников, что значительно затрудняет

развитие метода;

– более низкую по сравнению с ВЭЖХ эффективность разделения;

– необходимость высокой коррозионной стойкости

хроматографической системы, особенно при определении

катионов.

2.1 История развития:

Изучение ионнообменных процессов началось уже в начале XIX в. с наблюдений о влиянии почв на химический состав контактирующих с ним солевых растворов. В конце 40-х годов Г. Томпсон отметил, что почва поглощает аммиак из внесенных органических удобрений, соответствующие опыты были проведены специалистом их Йорка Д. Спенсом. Первые результаты опытов Д. Спенса были опубликованы Г. Томпсоном в 1850 г. В статье отмечается, что “первое открытие высоковажных свойств почвы может едва не потерпеть неудачу как полезное для сельского хозяйства” и его последнии работы были опубликованны е в 1852 и 1855 гг.

2.3 Принципы разделения ионов в сорбционных процессах

Ионообменная хроматография относится к жидкостно-твердофазной хроматографии, в которой подвижной фазой является жидкость (элюент), а неподвижной фазой – твердое тело (ионообменник). В основе метода ионообменной хроматографии лежит динамический процесс замещения ионов, связанных с неподвижной фазой, ионами элюента, поступающими в колонку. Разделение происходит благодаря разному сродству к ионообменнику ионов, находящихся в смеси, что приводит к различным скоростям их перемещения по колонке.

Ионная хроматография представляет собой вариант колоночной ионообменной хроматографии.

Согласно рекомендациям ИЮПАК (1993 г.) термины ионообменная (ИОХ) и ионная (ИХ) хроматография определяются следующим образом. "Ионообменная хроматография основана на различии ионообменных взаимодействий для индивидуальных анализируемых веществ. Если ионы разделяются и могут быть детектированы с помощью кондуктометрического детектора или косвенного УФ - детектирования, то она называется ионной хроматографией".

Современная (2005 г.) формулировка: "Ионная хроматография включает все высокоэффективные жидкостные хроматографические (ВЭЖХ) разделения ионов в колонках, объединенные с непосредственным детектированием в проточном детекторе и количественной обработкой полученных аналитических сигналов". Это определение характеризует ионную хроматографию безотносительно механизма разделения и метода детектирования и тем самым отделяет еѐ от классического ионного обмена.

В ионной хроматографии применяются следующие принципы разделения:

Ионный обмен.

Образования ионных пар.

Эксклюзия ионов.

Ионный обмен

Ионный обмен представляет собой обратимую гетерогенную реакцию эквивалентного обмена ионов, находящихся в фазе ионита (противоионов), наионы элюента. Противоиионы удерживаются функциональными группами ионита за счет электростатических сил. Как правило, в катионной хроматографии эти группы являются группами сульфоновых кислот; в случае анионной хроматографии – четвертичных аммониевых оснований. На рис. 1 представлена схема процесса обмена катионов и анионов. Ионы определяемого вещества обозначены как А, ионы элюента, конкурирующие с ними за обменные центры, - Е.

Рис. 1. Ионный обмен катионов (А+) и анионов (А-) на ионы элюента (Е+ или Е-) с участием катионообменника, содержащего функциональные сульфогруппы – SO3-, и анионообменника (группы четвертичного аммониевого основания –N+R3).

Образование ионных пар

Для реализации этого механизма разделения применяют ион-парные реагенты, которые добавляют в раствор элюента. Такие реагенты представляют собой анионные или катионные поверхностно-активные вещества, например, алкилсульфоновые кислоты или тетраалкиламмониевые соли.

Вместе с противоположно заряженными определяемыми ионами ионы этого ион-парного реагента образуют незаряженную ионную пару, которая может удерживаться на неподвижной фазе за счет межмолекулярных взаимодействий. Разделение осуществляется за счет различия констант образования ионных пар и степени их адсорбции на матрице сорбента. На рис. 2 показана статическая ионообменная модель в ион-парной хроматографии после адсорбции реагента на неподвижной фазе. Этот принцип разделения применяется как для анионов, так и для катионов .

Рис. 2 . Ионообменная модель в ион-парной хроматографии.

Ионная эксклюзия

Ионоэксклюзионная хроматография (ИЭХ). в основном, применяется для разделения слабых кислот или оснований. Наибольшее значение ИЭХ имеет для определения карбоновых и аминокислот, фенолов, углеводов.

На рис. 3 показан принцип разделения с помощью ИЭХ на примере кислот R–COOH.

Рис. 3. Схема разделения карбоновых кислот R–COOH с использованием ионоэксклюзионной хроматографии.

В ионоэксклюзионной хроматографии в качестве неподвижной фазы часто применяют полностью сульфированный катионообменник, содержащий ионыводорода (противоионы). В водном растворе элюента сульфокислотные группы ионита гидратируются. Гидратная оболочка ограничивается воображаемой отрицательно заряженной мембраной (Доннановской мембраной). Мембрана проницаема только для недиссоциированных молекул (например, воды).

Органические карбоновые кислоты могут быть разделены, если в качестве элюента применяются сильные минеральные кислоты. Вследствие низких значений констант кислотности карбоновые кислоты присутствуют в таких растворах в недиссоциированной форме. Эти формы могут проходить через мембрану Доннана и адсорбироваться на неподвижной фазе.

Хроматографические методики превалируют среди других при контроле качества воздуха рабочей зоны в промышленности и индустриальной гигиене; они являются основой подавляющего большинства токсикологических исследований; с помощью газовой хроматографии медики смогли изучить «синдром больного здания» - плохое самочувствие и некоторые заболевания, вызываемые присутствием в воздухе жилых помещений и административных зданий большого количества вредных химических веществ, выделяемых из синтетических материалов (ковров, дорожек, панелей, линолеума, обивки мебели и др.), мастик, лаков, аппретур и других продуктов бытовой химии, а также газовыделений при работе лазерных принтеров и газовых калориферов.[ ...]

Процесс хроматографического разделения основан на сорбции, с которой мы встречаемся в повседневной жизни - это поглощение веществ твердой поверхностью (адсорбция) или растворение газов и жидкостей в жидких растворителях (абсорбция). Самое известное применение адсорбции - очистка воздуха в противогазах: адсорбент (активный уголь), заполняющий коробку противогаза, удерживает вредные примеси или ОВ, содержащиеся в воздухе. Абсорбция характерна для многих биологических процессов, в частности для процесса дыхания. Поглощение кислорода гемоглобином крови в легких - тоже в определенной степени хроматографический процесс, так как при этом происходит сорбционное отделение кислорода от других газов, присутствующих во вдыхаемом воздухе. К сожалению, содержащиеся в воздухе вредные для организма примеси тоже поглощаются кровью и иногда необратимо.[ ...]

Человеком, который впервые сумел правильно объяснить процесс сорбции (явления, происходящие при движении вещества вдоль слоя сорбента), был русский ученый Михаил Семенович Цвет. Используя эти явления, он создал замечательный аналитический метод, показал его широкие возможности и дал название, которое и по сей день мы применяем для обозначения не только метода, но также и самого процесса и научной дисциплины, его изучащей .[ ...]

Но так как разные вещества по-разному извлекались бензолом из адсорбента (мела), они опускались по трубке с разной скоростью. Поэтому первоначальное зеленое кольцо, опускаясь, постепенно расширялось и делилось на несколько цветных колец. В конце концов этих колец оказалось шесть: верхнее желтое, затем оливково-зеленое, далее темно-зеленое и три желтых.[ ...]

Цвет извлек слой мела из трубки, разрезал его на цилиндрики, в каждом из которых оказалось свое цветное кольцо. Теперь можно было извлечь вещества из адсорбента спиртом и исследовать. В результате ученый показал, что хлорофилл - это не индивидуальное соединение, а смесь двух веществ, которые разделились на колонке с мелом и дали оливково-зеленое и темно-зе-леное кольца. Остальные вещества были ксантофилами.[ ...]

Цвет назвал получаемую при разделении веществ разноцветную картину хроматограммой, а сам метод (основанный на разделении веществ по их склонности к адсорбции) хроматографическим адсорбционным анализом, или хроматографией .[ ...]

До 1914 г. Цвет опубликовал несколько статей по хроматографии, но после его работ метод не получил широкого развития. Лишь в 1931 г. Кун, Винтерштейн и Ледерер воспроизвели первоначальные опыты Цвета (на примерах разделения каротина моркови, лепестков одуванчика и желтка куриного яйца). Столь длительное забвение ставших теперь классическими исследований в немалой степени было связано с отрицательными отзывами авторитетов того времени, которые не смогли понять всей глубины открытия молодого ученого.[ ...]

За разработку метода распределительной хроматографии и различных ее вариантов Мартин и Синг в 1952 г. были удостоены Нобелевской премии. Именно с этого момента начался современный этап развития газовой хроматографии (1951-1952 гг.), когда А. А. Жуховицкий с сотрудниками (Россия) предложили хроматермографию, а А. Мартин и А. Джемс - газо-жидкостную хроматографию, с помощью которой им удалось разделить смесь жирных кислот на колонке с диатомитовым носителем (целит-545), пропитанным парафиновым маслом с добавкой стеариновой кислоты. Такой сорбент поглощает анализируемые вещества гораздо слабее, чем, например, активный уголь или оксид алюминия, поэтому Джемсу и Мартину удалось разделить летучие органические кислоты в потоке газа - азота.[ ...]

С этого момента газовая хроматография стала одним из самых распространенных методов анализа, с помощью которого можно исследовать чрезвычайно широкий спектр веществ - от газов до высокомолекулярных жидкостей и металлов .[ ...]

Следует уточнить некоторые вопросы терминологии, касающиеся классификации хроматографических методов. В самом простейшем случае под термином «газовая хроматография» подразумевается метод анализа, когда разделение смеси веществ в хроматографической колонке осуществляется в потоке газа (газа-носителя), непрерывно пропускаемого через колонку. Газоадсорбционная (разделение на адсорбенте - угле, силикагеле или оксиде алюминия) и газо-жидкостная (разделение на сорбенте - твердый носитель, покрытый жидкостью - неподвижной жидкой фазой) - это все варианты газовой хроматографии.

По принципу фракционирования:

Аффиная хроматография

Гель-фильтрация

Адсорбционная

Осадочная

Адсорбционно-комплексообразовательная

Распределительная (нормально фазная, обращено фазная).

По способу эволюции:

Вытеснительная хроматография

Хроматографическая эволюция

Фронтальный анализ

Ионообменная хроматография.

По расположению неподвижной фазы:

Колоночная хром

Хроматография в толстом слое

Тонкослойная хроматография

Бумажная (на пленке) хроматография.

По агрегатному составу фаз:

Сверх критическая флюидная хроматография

Жидкостная хроматография (жидкостно-гелевая,жидкостно-жидкостная, жидкостно-твердофазная)

Газовая хроматография (газовотвердофазная, газовожидкостная).

По цели поведения:

Аналитическая

Препаративная

Промышленная.

По давлению в хроматографической системе:

Высокого давления

Низкого давления.

2.История развития жидкостной хроматографии.

Хроматография была открыта М С Цветом в 1903 г в виде колоночного жидкостно-адсорбционного метода В этом методе использовались адсорбенты с размером зерен более 50-100 мкм, элюент проходил через колонку самотеком за счет силы тяжести, проточных детекторов не было Разделение происходило медленно,в течение нескольких часов, и в таком режиме жидкостная хроматография не могла быть использована для аналитических целей. В 1965-1970 гг усилия специалистов в различных странах были направлены на создание экспрессной жидкостной хроматографии. Было ясно, что для увеличения скорости разделения нужно сократить пути внешней и внутренней диффузии. Этого можно было добиться за счет уменьшения диаметра зерен адсорбентов Заполнение колонок мелкими зернами (5-10 мкм) создавало большое входное давление, что потребовало применения насосов высокого давления. Так появилась жидкостная хроматография высокого давления. При переходе к адсорбентам мелкой фракции сильно возросла эффективность колонок (в расчете на единицу длины в сотни раз выше эффективности колонок в газовой хроматографии), поэтому современную экспрессную аналитическую жидкостную хроматографию назвали высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) Разработка жестких адсорбентов мелкого зернения (5 или 10 мкм), создание насосов высокого давления (свыше 200 атм) и проточных детекторов - все это обеспечило высокие характеристики ВЭЖХ По временам разделения она не уступала газовой хроматографии, а по областям применения значительно ее превзошла. Этот период времени стали называть вторым рождением жидкостной хроматографии, возрождением, периодом ее ренессанса. Одним из первых коммерческих жидкостных хроматографов была модель 820 фирмы «Du Pont» (1968) Этому предшествовала разработка серии детекторов для жидкостной хроматографии кондуктометрического детектора (1951), детектора по теплоте адсорбции (1959), рефрактометрического детектора (1962), УФ-детектора (1966), системы жидкостный хроматограф/масспектрометр (1973), первого варианта детектора на диодной матрице (1976) В 1969 г И Халаш и И Себастьян предложили сорбенты с химически привитыми алкильными цепями («щеточные сорбенты») со связями Si - О -С Эта связь оказалась неустойчивой В 1970 г Дж Киркланд разработал сорбенты с более устойчивыми связями Si-О-Si. Ради справедливости следует отметить, что такое модифицирование значительно раньше (1959) было предложено К.Д. Щербаковой и А.В. Киселевым.

У нас в стране жидкостные хроматографы были разработаны в 1969-1972 гг., это модели Цвет-1-69, Цвет-304, ХГ-1301.

Современный этап ВЭЖХ: В настоящее время ВЭЖХ занимает ведущие

позиции среди других методов хроматографии как по объему выпускаемой аппаратуры (боле 40000 хроматографов в год на сумму более 2 млрд. долл.), так и по числу публикаций (5-6 тыс. публик аций в год).

Велика роль ВЭЖХ и в таких жизненно важных областях науки и производства, как биология, биотехнология, пищевая промышленность, медицина, фармацевтика, судебно-медицинская экспертиза, контроль загрязнения окружающей среды и др. ВЭЖХ сыграла одну из основных ролей в расшифровке генома человека, в последние годы успешно решает за-

дачи протеомики.