Молекулярная биология пережила период бурного развития собственных методов исследования, которыми теперь отличается от биохимии. К ним, в частности, относятся методы генной инженерии , клонирования , искусственной экспрессии и нокаута генов . Поскольку ДНК является материальным носителем генетической информации, молекулярная биология значительно сблизилась с генетикой , и на стыке образовалась молекулярная генетика , являющаяся одновременно разделом генетики и молекулярной биологии. Так же, как молекулярная биология широко применяет вирусы как инструмент исследования, в вирусологии для решения своих задач используют методы молекулярной биологии. Для анализа генетической информации привлекается вычислительная техника, в связи с чем появились новые направления молекулярной генетики, которые иногда считают особыми дисциплинами: биоинформатика , геномика и протеомика .
История развития
Это основополагающее открытие было подготовлено длительным этапом исследований генетики и биохимии вирусов и бактерий .
В 1928 году Фредерик Гриффит впервые показал, что экстракт убитых нагреванием болезнетворных бактерий может передавать признак патогенности неопасным бактериям. Исследование трансформации бактерий в дальнейшем привело к очистке болезнетворного агента, которым, вопреки ожиданиям, оказался не белок , а нуклеиновая кислота . Сама по себе нуклеиновая кислота не опасна, она лишь переносит гены, определяющие патогенность и другие свойства микроорганизма.
В 50-х годах XX века было показано, что у бактерий существует примитивный половой процесс, они способны обмениваться внехромосомной ДНК, плазмидами . Открытие плазмид, как и трансформации , легло в основу распространённой в молекулярной биологии плазмидной технологии . Ещё одним важным для методологии открытием стало обнаружение в начале XX века вирусов бактерий, бактериофагов . Фаги тоже могут переносить генетический материал из одной бактериальной клетки в другую. Заражение бактерий фагами приводит к изменению состава бактериальной РНК . Если без фагов состав РНК сходен с составом ДНК бактерии, то после заражения РНК становится больше похожа на ДНК бактериофага. Тем самым было установлено, что структура РНК определяется структурой ДНК. В свою очередь, скорость синтеза белка в клетках зависит от количества РНК-белковых комплексов. Так была сформулирована центральная догма молекулярной биологии : ДНК ↔ РНК → белок.
Дальнейшее развитие молекулярной биологии сопровождалось как развитием её методологии, в частности, изобретением метода определения нуклеотидной последовательности ДНК (У. Гилберт и Ф. Сенгер , Нобелевская премия по химии 1980 года), так и новыми открытиями в области исследований строения и функционирования генов (см. История генетики). К началу XXI века были получены данные о первичной структуре всей ДНК человека и целого ряда других организмов, наиболее важных для медицины, сельского хозяйства и научных исследований, что привело к возникновению нескольких новых направлений в биологии: геномики, биоинформатики и др.
См. также
- Молекулярная биология (журнал)
- Транскриптомика
- Молекулярная палеонтология
- EMBO - Европейская организация молекулярных биологов
Литература
- Сингер М., Берг П. Гены и геномы. - Москва, 1998.
- Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. - Москва, 1981.
- Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. - 1989.
- Патрушев Л. И. Экспрессия генов. - М.: Наука, 2000. - 000 с., ил. ISBN 5-02-001890-2
Ссылки
Wikimedia Foundation . 2010 .
- Ардатовский район Нижегородской области
- Арзамасский район Нижегородской области
Смотреть что такое "Молекулярная биология" в других словарях:
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ - изучает осн. свойства и проявления жизни на молекулярном уровне. Важнейшими направлениями в М. б. являются исследования структурно функциональной организации генетического аппарата клеток и механизма реализации наследственной информации… … Биологический энциклопедический словарь
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ - исследует основные свойства и проявления жизни на молекулярном уровне. Выясняет, каким образом и в какой мере рост и развитие организмов, хранение и передача наследственной информации, превращение энергии в живых клетках и др. явления обусловлены … Большой Энциклопедический словарь
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ Современная энциклопедия
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ - МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, биологическое изучение строения и функционирования МОЛЕКУЛ, из которых состоят живые организмы. К основным сферам изучения относятся физические и химические свойства белков и НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, таких как ДНК. см. также… … Научно-технический энциклопедический словарь
молекулярная биология - раздел биол., который исследует основные свойства и проявления жизни на молекулярном уровне. Выясняет, каким образом и в какой мере рост и развитие организмов, хранение и передача наследственной информации, превращение энергии в живых клетках и… … Словарь микробиологии
молекулярная биология - — Тематики биотехнологии EN molecular biology … Справочник технического переводчика
Молекулярная биология - МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, исследует основные свойства и проявления жизни на молекулярном уровне. Выясняет, каким образом и в какой мере рост и развитие организмов, хранение и передача наследственной информации, превращение энергии в живых клетках и… … Иллюстрированный энциклопедический словарь
Молекулярная биология - наука, ставящая своей задачей познание природы явлений жизнедеятельности путём изучения биологических объектов и систем на уровне, приближающемся к молекулярному, а в ряде случаев и достигающем этого предела. Конечной целью при этом… … Большая советская энциклопедия
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ - изучает явления жизни на уровне макромолекул (гл. обр. белков и нуклеиновых к т) в бесклеточных структурах (рибосомы и др.), в вирусах, а также в клетках. Цель М. б. установление роли и механизма функционирования этих макромолекул на основе… … Химическая энциклопедия
молекулярная биология - исследует основные свойства и проявления жизни на молекулярном уровне. Выясняет, каким образом и в какой мере рост и развитие организмов, хранение и передача наследственной информации, превращение энергии в живых клетках и другие явления… … Энциклопедический словарь
Книги
- Молекулярная биология клетки. Сборник задач , Дж. Уилсон, Т. Хант. Книга американских авторов - приложение ко 2 - му изданию учебника `Молекулярная биология клетки` Б. Албертса, Д. Брея, Дж. Льюиса и др. Содержит вопросы и задачи, цель которых - углубить…
Развитие биохимии, биофизики, генетики, цитохимии, многих разделов микробиологии и вирусологии примерно к началу 40-х годов XX в. вплотную подвело к изучению жизненных явлений на молекулярном уровне. Успехи, достигнутые этими науками, одновременно и с разных сторон привели к осознанию того факта, что именно на молекулярном уровне функционируют основные управляющие системы организма и что дальнейший прогресс этих наук будет зависеть от раскрытия биологических функций молекул, составляющих тела организмов, их участия в синтезе и распаде, взаимных превращениях и репродукции соединений в клетке, а также происходящего при этом обмена энергией и информацией. Так на стыке этих биологических дисциплин с химией и физикой возникла совершенно новая отрасль - молекулярная биология.
В отличие от биохимии, внимание современной молекулярной биологии сосредоточено преимущественно на изучении структуры и функции важнейших классов биополимеров - белков и нуклеиновых кислот, первые из которых определяют самую возможность протекания обменных реакций, а вторые - биосинтез специфических белков. Понятно поэтому, что провести четкое разграничение молекулярной биологии и биохимии, соответствующих разделов генетики, микробиологии и вирусологии невозможно.
Возникновение молекулярной биологии было тесно связано с разработкой новых методов исследования, о которых уже говорилось в соответствующих главах. Наряду с развитием электронной микроскопии и других методов микроскопической техники большую роль сыграли разработанные в 50-х годах методы фракционирования клеточных элементов. Они основывались на усовершенствованных методах дифференциального центрифугирования (А. Клод, 1954). К этому времени уже имелись довольно надежные методы выделения и фракционирования биополимеров. Сюда относится, в частности, предложенный А. Тизелиусом (1937; Нобелевская премия, 1948) метод фракционирования белков при помощи электрофореза, методы выделения и очистки нуклеиновых кислот (Е. Кей, А. Даунс, М. Севаг, А. Мирский и др.). Параллельно во многих лабораториях мира разрабатывались различные методы хроматографического анализа (А. Мартин и Р. Синг, 1941; Нобелевская премия, 1952), впоследствии существенно усовершенствованные.
Неоценимую услугу в расшифровке структуры биополимеров сыграл рентгеноструктурный анализ. Основные принципы рентгеноструктурного анализа были разработаны в Королевском колледже Лондонского университета под руководством У. Брегга группой исследователей, куда входили Дж. Бернал, А. Лондсдейл, У. Астбери, Дж. Робертсон и др.
Следует особо отметить исследования профессора Московского государственного университета А. Р. Кизеля по биохимии протоплазмы (1925 - 1929), имевшие важнейшее значение для последующего становления молекулярной биологии. Кизель нанес удар прочно укоренившемуся представлению, что в основе всякой протоплазмы лежит особое белковое тело - пластин, будто бы определяющее все ее важнейшие структурные и функциональные особенности. Он показал, что пластин - это белок, который встречается только у миксомицетов, и то на определенной стадии развития, и что никакого постоянного компонента - единого скелетного белка - в протоплазме не существует. Тем самым изучение проблемы строения протоплазмы и функциональной роли белков вышло на правильный путь и получило простор для своего развития. Исследования Кизеля завоевали мировое признание, стимулировав изучение химии составных частей клетки.
Термин "молекулярная биология", впервые использованный английским кристаллографом профессором Лидского университета У. Астбери, появился, вероятно, в начале 40-х годов (до 1945 г.). Основополагающие рентгеноструктурные исследования белков и ДНК, проведенные Астбери в 30-х годах, послужили основой для последующей успешной расшифровки вторичной структуры этих биополимеров. В 1963 г. Дж. Бернал писал: "Памятник ему будет установлен всей молекулярной биологией - наукой, которую он назвал и действительно основал" * , В литературе этот термин появился впервые, пожалуй, в 1946 г. в статье У. Астбери "Прогресс рентгеноструктурного анализа органических и фибриллярных соединений", опубликованной в английском журнале "Природа" ** . В своей Гарвеевской лекции Астбери (1950) отмечал: "Мне приятно, что сейчас термин молекулярная биология уже довольно широко употребляется, хотя мало вероятно, что я первым предложил его. Он мне нравился и я уже давно старался его распространять" *** . Уже в 1950 г. Астбери было ясно, что молекулярная биология имеет дело прежде всего со структурой и конформацией макромолекул, изучение которых имеет решающее значение для понимания функционирования живых организмов.
* (Biogr. Mem. Fellows Roy. Soc, 1963, v. 9, 29. )
** (W. T. Astbury. Progress of X-ray analysis of organic and fibre structures.- Nature,. 1946, v. 157, 121. )
*** (W. T. Astbury. Adventures in Molecular Biology. Thomas Springfield, 1952, p. 3. )
Перед молекулярной биологией стояли и стоят, собственно, те же задачи, что и перед всей биологией в целом,- познание сущности жизни и ее основных явлений, в частности таких, как наследственность и изменчивость. Современная молекулярная биология в первую очередь призвана расшифровать структуру и функцию генов, пути и механизмы реализации генетической информации организмов на разных стадиях онтогенеза и на разных этапах ее считывания. Она призвана вскрыть тонкие механизмы регуляции активности генов и клеточной дифференцировки, выяснить природу мутагенеза и молекулярные основы эволюционного процесса.
Установление генетической роли нуклеиновых кислот
Для становления молекулярной биологии наибольшее значение имели следующие открытия. В 1944 г. американские исследователи О. Эвери, К. Мак-Леод (Нобелевская премия, 1923) и М. Мак-Карти показали, что выделенные из пневмококков молекулы ДНК обладают трансформирующей активностью. После гидролиза этих ДНК дезоксирибонуклеазой их трансформирующая активность полностью исчезала. Тем самым впервые было убедительно доказано, что генетическими функциями в клетке наделена именно ДНК, а не белок.
Справедливости ради следует заметить, что явление бактериальной трансформации было обнаружено значительно ранее открытия Эвери, Мак-Леода и Мак-Карти. В 1928 г. Ф. Гриффит опубликовал статью, в которой сообщил, что после добавления к невирулентным (некапсулированным) пневмококкам убитых клеток капсулированного вирулентного штамма получаемая смесь клеток становится губительной для мышей. Более того, выделяемые из зараженных этой смесью животных живые клетки пневмококков были уже вирулентными и обладали полисахаридной капсулой. Тем самым в этом опыте было показано, что под воздействием каких-то компонентов убитых клеток пневмококков некапсулированная форма бактерий превращается в капсулообразующую вирулентную форму. 16 лет спустя Эвери, Мак-Леод и Мак-Карти заменили в этом опыте убитые целые клетки пневмококков их дезоксирибонуклеиновой кислотой и показали, что именно ДНК обладает трансформирующей активностью (см. также главы 7 и 25). Значение этого открытия трудно переоценить. Оно стимулировало изучение нуклеиновых кислот во многих лабораториях мира и заставило сконцентрировать внимание ученых именно на ДНК.
Наряду с открытием Эвери, Мак-Леода и Мак-Карти к началу 50-х годов уже накопилось довольно большое количество прямых и косвенных данных о том, что нуклеиновые кислоты играют исключительную роль в жизнедеятельности и несут генетическую функцию. На это, в частности, указывал и характер локализации ДНК в клетке и данные Р. Вендрели (1948) о том, что содержание ДНК на клетку строго постоянно и коррелирует со степенью плоидности: в гаплоидных половых клетках ДНК вдвое меньше, чем в диплоидных соматических. В пользу генетической роли ДНК свидетельствовала также ее выраженная метаболическая стабильность. К началу 50-х годов накопилось много разнообразных фактов, свидетельствовавших о том, что большинство известных мутагенных факторов действуют преимущественно на нуклеиновые кислоты и, в особенности, на ДНК (Р. Хочкисс, 1949; Г. Эфрусси-Тейлор, 1951; Э. Фриз, 1957 и др.).
Особое значение в установлении генетической роли нуклеиновых кислот имело изучение различных фагов и вирусов. В 1933 г. Д. Шлезингер нашел ДНК в бактериофаге кишечной палочки. С момента выделения У. Стенли (1935, Нобелевская премия, 1946) вируса табачной мозаики (ВТМ) в кристаллическом состоянии начался новый этап в изучении растительных вирусов. В 1937 - 1938 гг. сотрудники Ротамстедской сельскохозяйственной станции (Англия) Ф. Боуден и Н. Пири показали, что многие выделенные ими растительные вирусы являются не глобулинами, а представляют собой рибонуклеопротеиды и содержат в качестве обязательного компонента нуклеиновую кислоту. В самом начале 40-х годов были опубликованы работы Г. Шрамма (1940), П. А. Агатова (1941), Г. Миллера и У. Стенли (1941), свидетельствовавшие о том, что заметная химическая модификация белкового компонента не приводит к утрате инфекционности ВТМ. Это указывало на то, что белковый компонент не может быть носителем наследственных свойств вируса, как продолжали считать многие микробиологи. Убедительные доказательства в пользу генетической роли нуклеиновой кислоты (РНК) у растительных вирусов были получены в 1956 г. Г. Шраммом в Тюбингене (ФРГ) и X. Френкель-Конратом в Калифорнии (США). Эти исследователи практически одновременно и независимо друг от друга выделили из ВТМ РНК и показали, что именно она, а не белок, обладает инфекционностью: в результате заражения растений табака этой РНК в них происходило формирование и размножение нормальных вирусных частиц. Это означало, что РНК содержит информацию для синтеза и сборки всех вирусных компонентов, в том числе и вирусного белка. В 1968 г. И. Г. Атабеков установил, что белок играет существенную роль при самом заражении растений - природой белка определяется спектр растений-хозяев.
В 1957 г. Френкель-Конрат впервые осуществил реконструкцию ВТМ из составляющих его компонентов - РНК и белка. Наряду с нормальными частицами он получил смешанные "гибриды", у которых РНК была от одного штамма, а белок - от другого. Наследственность таких гибридов полностью определялась РНК, и потомство вирусов принадлежало к тому штамму, РНК которого была использована для получения исходных смешанных частиц. Позднее опыты А. Гирера, Г. Шустера и Г. Шрамма (1958) и Г. Витмана (1960 - 1966) показали, что химическая модификация нуклеинового компонента ВТМ приводит к появлению разнообразных мутантов этого вируса.
В 1970 г. Д. Балтимор и Г. Темин установили, что перенос генетической информации может происходить не только от ДНК к РНК, но и наоборот. Они обнаружили у некоторых онкогенных РНК-содержащих вирусов (онкорнавирусы) особый фермент, так называемую обратную транскриптазу, который способен на цепях РНК комплементарно синтезировать ДНК. Это крупное открытие позволило понять механизм встройки в геном хозяина генетической информации РНК-содержащих вирусов и по-новому взглянуть на природу их онкогенного действия.
Открытие нуклеиновых кислот и изучение их свойств
Термин нуклеиновые кислоты был введен немецким биохимиком Р. Альтманом в 1889 г., после того как эти соединения были открыты в 1869 г. швейцарским врачом Ф. Мишером. Мишер экстрагировал клетки гноя разбавленной соляной кислотой в течение нескольких недель и получил в остатке почти чистый ядерный материал. Этот материал он считал характерным" веществом клеточных ядер и назвал его нуклеином. По своим свойствам нуклеин резко отличался от белков: он был более кислым, не содержал серу, но зато в нем было много фосфора, он хорошо растворялся в щелочах, но не растворялся в разбавленных кислотах.
Результаты своих наблюдений над нуклеином Мишер направил Ф. Гоппе-Зейлеру для опубликования в журнале. Описанное им вещество было настолько необычным (в то время из всех биологических фосфорсодержащих соединений был известен только лецитин), что Гоппе-Зейлер не поверил опытам Мишера, вернул ему рукопись и поручил своим сотрудникам Н. Плошу и Н. Любавину проверить его выводы на другом материале. Работа Мишера "О химическом составе клеток гноя" вышла в свет двумя годами позже (1871). В то же время были опубликованы работы Гоппе-Зейлера и его сотрудников о составе клеток гноя, эритроцитов птиц, змей и других клеток. В течение последующих трех лет нуклеин был выделен из животных клеток и дрожжей.
В своей работе Мишер отмечал, что детальное изучение разных нуклеинов может привести к установлению различий между ними, предвосхитив тем самым идею специфичности нуклеиновых кислот. Исследуя молоки лосося, Мишер установил, что нуклеин находится в них в виде соли и связан с основным белком, который он назвал протамином.
В 1879 г. в лаборатории Гоппе-Зейлера изучением нуклеинов начал заниматься А. Коссель. В 1881 г. он выделил из нуклеина гипоксантин, однако в то время он еще сомневался в происхождении этого основания и считал, что гипоксантин может быть продуктом деградации белков. В 1891 г. в числе продуктов гидролиза нуклеина Коссель обнаружил аденин, гуанин, фосфорную кислоту и еще одно вещество со свойствами сахара. За исследования по химии нуклеиновых кислот Косселю в 1910 г. была присуждена Нобелевская премия.
Дальнейшие успехи в расшифровке структуры нуклеиновых кислот связаны с исследованиями П. Левина и сотрудников (1911 - 1934). В 1911 г. П. Левин и В. Жакобс идентифицировали углеводный компонент аденозина и гуанозина; они установили, что в состав этих нуклеозидов входит D-рибоза. В 1930 г. Левин показал, что углеводным компонентом дезоксирибонуклеозидов является 2-дезокси-D-рибоза. Из его работ стало известно, что нуклеиновые кислоты построены из нуклеотидов, т. е. фосфорилированных нуклеозидов. Левин считал, что основным типом связи в нуклеиновых кислотах (РНК) является 2", 5"-фосфодиэфирная связь. Это представление оказалось ошибочным. Благодаря работам английского химика А. Тодда (Нобелевская премия, 1957) и его сотрудников, а также английских биохимиков Р. Маркхема и Дж. Смита в начале 50-х годов стало известно, что основным типом связи в РНК является 3", 5"-фосфодиэфирная связь.
Левин показал, что разные нуклеиновые кислоты могут различаться по природе углеводного компонента: одни из них содержат сахар дезоксирибозу, а другие - рибозу. Кроме того, указанные два типа нуклеиновых кислот различались по природе одного из оснований: в нуклеиновых кислотах пентозного типа содержался урацил, а в нуклеиновых кислотах дезоксипентозного типа - тимин. Дезоксипентозную нуклеиновую кислоту (по современной терминологии, дезоксирибонуклеиновая кислота - ДНК) обычно легко выделяли в больших количествах из тимуса (зобной железы) телят. Поэтому она получила название тимонуклеиновой кислоты. Источником нуклеиновой кислоты пентозного типа (РНК) служили главным образом дрожжи и зародыши пшеницы. Этот тип часто называли дрожжевой нуклеиновой кислотой.
В начале 30-х годов довольно прочно укоренилось представление, будто для растительных клеток характерна нуклеиновая кислота дрожжевого типа, а тимонуклеиновая кислота свойственна только ядрам животных клеток. Два типа нуклеиновых кислот - РНК и ДНК - в то время называли соответственно растительной и животной нуклеиновыми кислотами. Однако, как показали ранние исследования А. Н. Белозерского, такое деление нуклеиновых кислот неоправданно. В 1934 г. Белозерский впервые обнаружил тимонуклеиновую кислоту в растительных клетках: из проростков гороха он выделил и идентифицировал тимин-пиримидиновое основание, характерное именно для ДНК. Затем он обнаружил тимин и в других растениях (семенах сои, фасоли). В 1936 г. А. Н. Белозерский и И. И. Дубровская выделили препаративно ДНК из проростков конского каштана. Кроме того, серия работ, выполненных в 40-х годах в Англии Д. Девидсоном с сотрудниками, убедительно показала, что растительная нуклеиновая кислота (РНК) содержится во многих животных клетках.
Широкое применение разработанной Р. Фельгеном и Г. Розенбеком (1924) цитохимической реакции на ДНК и реакции Ж. Браше (1944) на РНК позволило довольно быстро и однозначно решить вопрос о преимущественной локализации этих нуклеиновых кислот в клетке. Оказалось, что ДНК сосредоточена в ядре, в то время как РНК преимущественно концентрируется в цитоплазме. Позднее было выяснено, что РНК содержится как в цитоплазме, так и в ядре, а кроме того, были выявлены цитоплазматические ДНК.
Что касается вопроса о первичной структуре нуклеиновых кислот, то к середине 40-х годов в науке прочно утвердилось представление П. Левина, согласно которому все нуклеиновые кислоты построены по одному типу и состоят из одинаковых так называемых тетрануклеотидных блоков. В каждом из этих блоков, по мнению Левина, содержится четыре разных нуклеотида. Тетрануклеотидная теория строения нуклеиновых кислот в значительной мере лишала эти биополимеры специфичности. Поэтому не удивительно, что всю специфику живого связывали в то время только с белками, природа мономеров которых гораздо разнообразнее (20 аминокислот).
Первую брешь в теории тетрануклеотидного строения нуклеиновых кислот пробили аналитические данные английского химика Дж. Гуланда (1945 - 1947). При определении состава нуклеиновых кислот по азоту оснований он не получил эквимолярного соотношения оснований, как это должно было бы быть согласно теории Левина. Окончательно тетрануклеотидная теория строения нуклеиновых кислот рухнула в результате исследований Э. Чаргаффа и его сотрудников (1949 - 1951). Для разделения оснований, выщепляющихся из ДНК в результате ее кислотного гидролиза, Чаргафф использовал хроматографию на бумаге. Каждое из этих оснований было точно определено спектрофотометрически. Чаргафф заметил значительные отклонения от эквимолярного соотношения оснований в ДНК разного происхождения и впервые определенно заявил, что ДНК обладает выраженной видовой специфичностью. Тем самым было покончено с гегемонией концепции о специфичности белка в живой клетке. Анализируя ДНК разного происхождения, Чаргафф открыл и сформулировал уникальные закономерности состава ДНК, вошедшие в науку под названием правил Чаргаффа. Согласно этим правилам, во всех ДНК, независимо от происхождения, количество аденина равно количеству тимина (А = Т), количество гуанина равно количеству цитозина (Г = Ц), количество пуринов равно количеству пиримидинов (Г + А = Ц + Т), количество оснований с 6-аминогруппами равно количеству оснований с 6-кетогруп-пами (А+Ц=Г+Т). Вместе с тем, несмотря на такие строгие количественные соответствия, ДНК разных видов отличаются по величине отношения А+Т:Г+Ц. В одних ДНК количество гуанина и цитозина преобладает над количеством аденина и тимина (эти ДНК Чаргафф назвал ДНК ГЦ-типа); другие ДНК содержали аденина и тимина больше, чем гуанина и цитозина (эти ДНК были названы ДНК АТ-типа). Полученные Чаргаффом данные по составу ДНК сыграли исключительную роль в молекулярной биологии. Именно они легли в основу открытия строения ДНК, сделанного в 1953 г. Дж. Уотсоном и Ф. Криком.
Еще в 1938 г. У. Астбери и Ф. Белл при помощи рентгеноструктурного анализа показали, что плоскости оснований в ДНК должны быть перпендикулярными к длинной оси молекулы и напоминать как бы стопку пластин, лежащих друг над другом. По мере совершенствования техники рентгеноструктурного анализа к 1952 - 1953 гг. накопились сведения, позволившие судить о длине отдельных связей и углах наклона. Это дало возможность с наибольшей вероятностью представить характер ориентации колец пентозных остатков в сахарофосфатном костяке молекулы ДНК. В 1952 г. С. Фарберг предложил две умозрительные модели ДНК, которые представляли сложенную или закрученную саму на себя однотяжную молекулу. Не менее спекулятивная модель строения ДНК была предложена в 1953 г. Л. Полингом (лауреат Нобелевской премии, 1954) и Р. Кори. В этой модели три закрученные цепи ДНК образовывали длинную спираль, стержень которой был представлен фосфатными группами, а основания располагались снаружи от него. К 1953 г. М. Уилкинс и Р. Франклин получили более четкие рентгеноструктурные картины ДНК. Их анализ показал полную несостоятельность моделей Фарберга, Полинга и Кори. Используя данные Чаргаффа, сопоставляя разные сочетания молекулярных моделей отдельных мономеров и данные рентгеноструктурного анализа, Дж. Уотсон и Ф. Крик в 1953 г. пришли к выводу, что молекула ДНК должна быть двутяжной спиралью. Правила Чаргаффа резко ограничили число возможных упорядоченных сочетаний оснований в предлагаемой модели ДНК; они подсказали Уотсону и Крику, что в молекуле ДНК должно быть специфическое спаривание оснований - аденина с тимином, а гуанина с цитозином. Иными словами аденину в одной цепи ДНК всегда строго соответствует тимин в другой цепи, а гуанину в одной цепи обязательно соответствует цитозин в другой. Тем самым Уотсон и Крик впервые сформулировали исключительной важности принцип комплементарного строения ДНК, согласно которому одна цепь ДНК дополняет другую, т. е. последовательность оснований одной цепи однозначно определяет последовательность оснований в другой (комплементарной) цепи. Стало очевидно, что уже в самой структуре ДНК заложена потенциальная возможность ее точного воспроизведения. Эта модель строения ДНК в настоящее время является общепризнанной. За расшифровку структуры ДНК Крику, Уотсону и Уилкинсу в 1962 г. была присуждена Нобелевская премия.
Следует отметить, что идея о механизме точного воспроизведения макромолекул и передаче наследственной информации зародилась в нашей стране. В 1927 г. Н, К. Кольцов высказал предположение, что при размножении клеток происходит репродукция молекул путем точного автокаталитического воспроизведения имевшихся материнских молекул. Правда, в то время Кольцов наделял этим свойством не молекулы ДНК, а молекулы белковой природы, о функциональном значении которых тогда ничего не было известно. Тем не менее сама мысль об автокаталитическом воспроизведении макромолекул и механизме передачи наследственных свойств оказалась пророческой: она стала руководящей идеей современной молекулярной биологии.
Проведенные в лаборатории А. Н. Белозерского А. С. Спириным, Г. Н. Зайцевой, Б. Ф. Ванюшиным, С. О. Урысон, А. С. Антоновым и другими многолетние исследования (1957-1974) состава ДНК у самых разнообразных организмов полностью подтвердили закономерности, обнаруженные Чаргаффом, и полное соответствие с молекулярной моделью строения ДНК, предложенной Уотсоном и Криком. Эти исследования показали, что ДНК разных бактерий, грибов, водорослей, актиномицетов, высших растений, беспозвоночных и позвоночных обладают специфичностью состава. Особенно резко различия в составе (содержании АТ-пар оснований) выражены у микроорганизмов, оказываясь важным таксономическим признаком. У высших растений и животных видовые вариации в составе ДНК выражены значительно слабее. Но это вовсе не означает, что ДНК у них менее специфична. Кроме состава оснований специфичность в большей степени определяется их последовательностью в цепях ДНК.
Наряду с обычными основаниями в составе ДНК и РНК были обнаружены дополнительные азотистые основания. Так, в составе ДНК растений и животных Г. Уайт (1950) нашел 5-метилцитозин, а Д. Данн и Дж. Смит (1958) обнаружили в некоторых ДНК метилированный аденин. Долгое время метилцитозин считался отличительной чертой генетического материала высших организмов. В 1968 г. А. Н. Белозерский, Б. Ф. Ванюшин и Н. А. Кокурина установили, что он может встречаться также и в ДНК бактерий.
В 1964 г. М. Голд и Дж. Хурвитц открыли новый класс ферментов, осуществляющих природную модификацию ДНК - ее метилирование. После этого открытия стало ясно, что минорные (содержащиеся в малых количествах) основания возникают уже на готовой полинуклеотидной цепи ДНК в результате специфического метилирования остатков цитозина и аденина в особых последовательностях. В частности, по данным Б. Ф. Ванюшина, Я. И. Бурьянова и А. Н. Белозерского (1969) метилирование аденина в ДНК кишечной палочки может происходить в терминирующих кодонах. По данным А. Н. Белозерского и сотрудников (1968 - 1970), а также М. Мезельсона (США) и В. Арбера (Швейцария) (1965 - 1969) метилирование придает молекулам ДНК уникальные индивидуальные черты и в сочетании с действием специфических нуклеаз является частью сложного механизма, который осуществляет контроль за синтезом ДНК в клетке. Иными словами, характер метилирования той или иной ДНК предопределяет вопрос о том, может ли она размножаться в данной клетке.
Практически в то же время началось выделение и интенсивное изучение ДНК-метилаз и рестрицирующих эндонуклеаз; в 1969 - 1975 гг. установлены нуклеотидные последовательности, узнаваемые в ДНК некоторыми из этих ферментов (X. Бойер, X. Смит, С. Линн, К. Муррей). При гидролизе разных ДНК рестрицирующим ферментом выщепляются довольно крупные фрагменты с одинаковыми "липкими" концами. Это дает возможность не только анализировать структуру генов, как это сделано у небольших вирусов (Д. Натанс, С. Адлер, 1973 - 1975), но и конструировать различные геномы. С открытием этих специфических ферментов рестрикции генетическая инженерия стала ощутимой реальностью. Встроенные в небольшие плазмидные ДНК гены различного происхождения уже легко вводят в различные клетки. Так, получен новый тип биологически активных плазмид, дающих устойчивость к некоторым антибиотикам (С. Коэн, 1973), введены рибосомальные гены лягушки и дрозофилы в плазмиды кишечной палочки (Дж. Морроу, 1974; X. Бойер, Д. Хогнесс, Р. Девис, 1974 - 1975). Таким образом, открыты реальные пути для получения принципиально новых организмов путем введения и встраивания в их генофонд разнообразных генов. Это открытие может быть направлено на благо всего человечества.
В 1952 г. Г. Уайт и С. Коэн обнаружили, что в ДНК Т-четных фагов содержится необычное основание - 5-оксиметилцитозин. Позднее из работ Е. Волькина и Р. Синсхеймера (1954) и Коэна (1956) стало известно, что остатки оксиметилцитозина могут быть полностью или частично глюкозидированы, в результате чего молекула фаговой ДНК оказывается защищенной от гидролитического действия нуклеаз.
В начале 50-х годов из работ Д. Данна и Дж. Смита (Англия), С. Заменхофа (США) и А. Вакера (ФРГ) стало известно, что в ДНК могут включаться многие искусственные аналоги оснований, замещая иногда до 50% тимина. Как правило, эти замещения приводят к ошибкам при репликации, транскрипции ДНК и трансляции и к появлению мутантов. Так, Дж. Мармур (1962) установил, что в ДНК некоторых фагов вместо тимина содержится оксиметилурацил. В 1963 г. И. Такахаши и Дж. Мармур обнаружили, что в ДНК одного из фагов вместо тимина содержится урацил. Таким образом, рухнул еще один принцип, по которому ранее разделяли нуклеиновые кислоты. Со времен работ П. Левина считалось, что отличительным признаком ДНК является тимин, а РНК - урацил. Стало ясно, что этот признак не всегда надежен, и принципиальным различием химической природы двух типов нуклеиновых кислот, как это представляется на сегодняшний день, служит только характер углеводного компонента.
При изучении фагов было вскрыто много необычных признаков организации нуклеиновых кислот. С 1953 г. считалось, что все ДНК представляют собой двутяжные линейные молекулы, а РНК - только однотяжные. Это положение существенно поколебалось в 1961 г., когда Р. Синсхеймер обнаружил, что ДНК фага φ X 174 представлена однотяжной кольцевой молекулой. Правда, затем выяснилось, что в такой форме эта ДНК существует только в вегетативной фаговой частице, а репликативная форма ДНК этого фага также двутяжная. Кроме того, весьма неожиданным оказалось, что РНК некоторых вирусов могут быть двутяжными. Этот новый тип макромолекулярной организации РНК был обнаружен в 1962 г. П. Гоматосом, И. Таммом и другими исследователями у некоторых вирусов животных и у вируса раневой опухоли растений. Недавно В. И. Агол и А. А. Богданов (1970) установили, что помимо линейных молекул РНК существуют также замкнутые или циклические молекулы. Циклическая двутяжная РНК выявлена ими, в частности, у вируса энцефаломиэлокардита. Благодаря работам X. Дево, Л. Тиноко, Т. И. Тихоненко, Э. И. Будовского и других (1960 - 1974) стали известны основные черты организации (укладки) генетического материала у бактериофагов.
В конце 50-х годов американский ученый П. Доти установил, что при нагревании происходит денатурация ДНК, сопровождающаяся разрывом водородных связей между парами оснований и расхождением комплементарных цепей. Этот процесс носит характер фазового перехода по типу "спираль-клубок" и напоминает плавление кристаллов. Поэтому процесс тепловой денатурации ДНК Доти назвал плавлением ДНК. При медленном охлаждении происходит ренатурацпя молекул, т. е воссоединение комплементарных половинок.
Принцип ренатурации в 1960 г. был использован Дж. Мармуром и К. Шильдкраутом для определения степени "гибридизуемости" ДНК разных микроорганизмов. Впоследствии Е. Болтон и Б. Мак-Карти усовершенствовали этот прием, предложив метод так называемых ДНК-агаровых колонок. Этот метод оказался незаменимым в изучении степени гомологии нуклеотидной последовательности разных ДНК и выяснении генетического родства разных организмов. Открытая Доти денатурация ДНК в сочетании с описанной Дж. Манделем и А. Херши * (1960) хроматографией на метилированном альбумине и центрифугированием в градиенте плотности (метод разработан в 1957 г. М. Мезельсоном, Ф. Сталем и Д. Виноградом) широко используется для разделения, выделения и анализа отдельных комплементарных цепей ДНК Так, например, В. Шибальски (США), используя эти приемы для разделения ДНК лямбда фага, показал в 1967 - 1969 гг., что генетически активными являются обе цепочки фага, а не одна, как это было принято считать (С. Спигельман, 1961). Следует отметить, что впервые идея о генетической значимости обеих цепочек ДНК лямбда фага была высказана в СССР С. Е. Бреслером (1961).
* (За работы по генетике бактерий и вирусов А. Херши совместно с М. Дельбрюком и С. Луриа были удостоены в 1969 г. Нобелевской премии. )
Для понимания организации и функциональной активности генома первостепенное значение имеет определение нуклеотидной последовательности ДНК. Поиски методов такого определения ведутся во многих лабораториях мира. В США М. Бир с сотрудниками с конца 50-х годов пытается установить последовательность ДНК при помощи электронной микроскопии, но пока безуспешно. В начале 50-х годов из первых работ Синсхеймера, Чаргаффа и других исследователей по ферментативной деградации ДНК стало известно, что разные нуклеотиды в молекуле ДНК распределены хотя и нехаотично, но неравномерно. По данным английского химика К. Бартона (1961), пиримидины (их более 70%) сосредоточены в основном в виде соответствующих блоков. А. Л. Мазин и Б. Ф. Ванюшин (1968 - 1969) установили, что разные ДНК обладают различной степенью сблоченности пиримидинов и что в ДНК животных организмов она заметно возрастает по мере перехода от низших к высшим. Таким образом, эволюция организмов отражена и в структуре их геномов. Именно поэтому для понимания эволюционного процесса в целом сравнительное изучение структуры нуклеиновых кислот приобретает особое значение. Анализ структуры биологически важных полимеров и, в первую очередь, ДНК крайне важен и для решения многих частных вопросов филогенетики и таксономии.
Интересно отметить, что английский физиолог Э. Ланкестер, изучавший гемоглобины моллюсков, ровно 100 лет назад предвосхитивший идеи молекулярной биологии, писал: "Химические различия разных видов и родов животных и растений имеют такое же важное значение для выяснения истории их происхождения, как и различия в их форме. Если бы мы могли четко устанавливать различия в молекулярной организации и функционировании организмов, мы смогли бы значительно лучше разобраться в происхождении и эволюции разных организмов, чем на основании морфологических наблюдений" * . Значимость биохимических исследований для систематики подчеркивал и В. Л. Комаров, который писал, что "в основе всех даже чисто морфологических признаков, на основании которых мы классифицируем и устанавливаем виды, лежат именно биохимические различия" ** .
* (Е. R. Lankester. Uber das Vorcommen von Haemoglobin in den Muskeln der Mollusken und die Verbreitung desselben in den lebendigen Organismen.- "Pfluger"s Archiv fur die gesammte Physiol., 1871, Bd 4, 319. )
** (В. Л. Комаров. Избранные соч., т. 1. М.-Л., Изд-во АН СССР, 1945, стр. 331. )
А. В. Благовещенский и С. Л. Иванов еще в 20-х годах предприняли первые в нашей стране шаги по выяснению некоторых вопросов эволюции и систематики организмов на основе сравнительного анализа их биохимического состава (см. гл. 2). Сравнительный анализ структуры белков и нуклеиновых кислот в настоящее время становится все более ощутимым подспорьем для систематиков (см. главу 21). Этот метод молекулярной биологии позволяет не только уточнить положение отдельных видов в системе, но и заставляет по-новому взглянуть на сами принципы классификации организмов, а иногда и пересмотреть всю систему в целом, как это случилось, например, с систематикой микроорганизмов. Несомненно, и в будущем анализ структуры генома будет занимать центральное место в хемосистематике организмов.
Огромное значение для становления молекулярной биологии имела расшифровка механизмов репликации ДНК и транскрипции (см главу 24).
Биосинтез белка
Важный сдвиг в решении проблемы биосинтеза белка связан с успехами в изучении нуклеиновых кислот. В 1941 г. Т. Касперсон (Швеция) и в 1942 г. Ж. Браше (Бельгия) обратили внимание на то, что в тканях с активным белковым синтезом содержится повышенное количество РНК. Они пришли к выводу, что рибонуклеиновые кислоты играют определяющую роль в синтезе белка. В 1953 г. Е. Гейл и Д. Фокс, как будто, получили прямые доказательства непосредственного участия РНК в биосинтезе белка: по их данным, рибонуклеаза существенно подавляла включение аминокислот в лизатах бактериальных клеток. Аналогичные данные были получены В. Олфри, М. Дели и А. Мирским (1953) на гомогенатах печени. Позднее Э. Гейл отказался от высказанной им правильной идеи о ведущей роли РНК в белковом синтезе, ошибочно считая, что активация белкового синтеза в бесклеточной системе происходила под влиянием какого-то другого вещества неизвестной природы. В 1954 г. П. Замечник, Д. Литлфилд, Р. Б. Хесин-Лурье и другие обнаружили, что наиболее активное включение аминокислот происходит в богатых РНК фракциях субклеточных частиц - микросом. П. Замечник и Э. Келлер (1953 - 1954) обнаружили, что включение аминокислот заметно усиливалось в присутствии надосадочной фракции в условиях регенерации АТФ. П. Сикевиц (1952) и М. Хогланд (1956) выделили из надосадочной жидкости белковую фракцию (рН 5 фракция), которая была ответственной за резкое стимулирование включения аминокислот в микросомах. Наряду с белками в надосадочной жидкости был обнаружен особый класс низкомолекулярных РНК, которые теперь называют транспортными РНК (тРНК). В 1958 г. Хогланд и Замечник, а также П. Берг, Р. Свит и Ф. Аллен и многие другие исследователи обнаружили, что для активации каждой аминокислоты необходим свой особый фермент, АТФ и специфическая тРНК. Стало ясно, что тРНК выполняют исключительно функцию адаптеров, т. е. приспособлений, которые находят на нуклеиновой матрице (иРНК) место соответствующей аминокислоте в формирующейся белковой молекуле. Эти исследования полностью подтвердили адапторную гипотезу Ф. Крика (1957), предусматривавшую существование в клетке полинуклеотидных адапторов, необходимых для правильного расположения аминокислотных остатков синтезирующегося белка на нуклеиновой матрице. Уже много позднее французский ученый Ф. Шапвиль (1962) в лаборатории Ф. Липмана (Нобелевская премия, 1953) в США весьма остроумно и однозначно показал, что местоположение аминокислоты в синтезирующейся белковой молекуле полностью определяется той специфической тРНК, к которой она присоединена. Адапторная гипотеза Крика была развита в работах Хогланда и Замечника.
К 1958 г. стали известны следующие основные этапы белкового синтеза: 1) активация аминокислоты специфическим ферментом из "рН 5 фракции" в присутствии АТФ с образованием аминоациладенилата; 2) присоединение активированной аминокислоты к специфической тРНК с высвобождением аденозинмонофосфата (АМФ); 3) связывание аминоацил-тРНК (тРНК, нагруженная аминокислотой) с микросомами и включение аминокислот в белок с высвобождением тРНК. Хогланд (1958) отметил, что на последнем этапе белкового синтеза необходим гуанозинтрифосфат (ГТФ).
Транспортные РНК и синтез гена
После обнаружения тРНК начались активные поиски их фракционирования и определения нуклеотидной последовательности. Наибольших успеходов добился американский биохимик Р. Холли. В 1965 г. он установил структуру аланиновой тРНК из дрожжей. При помощи рибонуклеаз (гуаниловая РНК-аза и панкреатическая РНК-аза) Холли разделил молекулу нуклеиновой кислоты на несколько фрагментов, определил в каждом из них по отдельности нуклеотидную последовательность и затем реконструировал последовательность всей молекулы аланиновой тРНК. Этот путь анализа нуклеотидной последовательности получил название блочного метода. Заслуга Холли состояла главным образом в том, что он научился разделять молекулу РНК не только на мелкие куски, как это делали многие и до него, но и на крупные фрагменты (четвертинки и половинки). Это и дало ему возможность правильно собрать отдельные маленькие куски воедино и тем самым воссоздать полную нуклеотидную последовательность всей молекулы тРНК (Нобелевская премия, 1968).
Этот прием сразу же был принят на вооружение во многих лабораториях мира. В течение последующих двух лет в СССР и за рубежом была расшифрована первичная структура сразу нескольких тРНК. А. А. Баев (1967) и сотрудники впервые установили последовательность нуклеотидов в дрожжевой валиновой тРНК. К настоящему времени изучено уже более десятка различных индивидуальных тРНК. Своеобразный рекорд в определении нуклеотидной последовательности установлен в Кембридже Ф. Сенгером и Г. Браунли. Эти исследователи разработали удивительно изящный метод разделения олигонуклеотидов и установили последовательность так называемой 5 S (рибосомной) РНК из клеток кишечной палочки (1968). Эта РНК состоит из 120 нуклеотидных остатков и в отличие от тРНК не содержит дополнительных минорных оснований, которые заметно облегчают анализ нуклеотидной последовательности, служа уникальными ориентирами отдельных фрагментов молекулы. В настоящее время благодаря использованию метода Сенгера и Браунли успешно продвигается работа по изучению последовательности длинных рибосомных РНК и некоторых вирусных РНК в лаборатории Ж. Эбеля (Франция) и других исследователей.
А. А. Баев и сотрудники (1967) обнаружили, что разрезанная пополам валиновая тРНК восстанавливает свою макромолекулярную структуру в растворе и, несмотря на дефект в первичной структуре, обладает функциональной активностью исходной (нативной) молекулы. Этот подход - реконструкция разрезанной макромолекулы после удаления определенных фрагментов - оказался весьма перспективным. Он широко используется сейчас для выяснения функциональной роли отдельных участков тех или иных тРНК.
В последние годы достигнут большое успех в получении кристаллических препаратов индивидуальных тРНК. Сейчас в нескольких лабораториях в США и Англии удалось закристаллизовать уже многие тРНК. Это позволило исследовать стуруктуру тРНК при помощи рентгеноструктурного анализа. В 1970 г. Р. Бок представил первые рентгенограммы и трехмерные модели нескольких тРНК, созданные им в Висконсинском университете. Эти модели помогают определить локализацию отдельных функционально активных участков в тРНК и понять основные принципы функционирования этих молекул.
Важнейшее значение для раскрытия механизма синтеза белка и решения проблемы специфичности этого процесса имела расшифровка природы генетического кода (см. главу 24), которую без преувеличения можно рассматривать как ведущее завоевание естествознания XX в.
Раскрытие Р. Холли первичной структуры тРНК дало толчок работам Г. Кораны * (США) по синтезу олигонуклеотидов и направило их на путь синтеза определенной биологической структуры - молекулы ДНК, кодирующей аланиновую тРНК. Сделанные Кораной почти 15 лет назад первые шаги по химическому синтезу коротких олигонуклеотидов завершились в 1970 г. впервые осуществленным синтезом гена. Корана и его сотрудники сначала из отдельных нуклеотидов синтезировали химическим путем короткие фрагменты длиной в 8-12 нуклеотидных остатков. Эти фрагменты с заданной нуклеотидной последовательностью образовывали спонтанно двутяжные комплементарные куски с перекрыванием в 4 - 5 нуклеотидов. Затем эти готовые куски в нужном порядке поочередно соединяли конец в конец при помощи фермента ДНК-лигазы. Таким образом, в отличие от репликации молекул ДНК, по А. Корнбергу ** (см. главу 24), Коране удалось заново создать молекулу естественной двутяжной ДНК по заранее намеченной программе в соответствии с последовательностью тРНК, описанной Холли. Аналогичным образом сейчас ведутся работы по синтезу других генов (М. Н. Колосов, 3. А. Шабарова, Д. Г. Кнорре, 1970 - 1975).
* (За исследования генетического кода Г. Коране и М. Ниренбергу была присуждена в 1968 г. Нобелевская премия. )
** (За открытие полимеразы и синтез ДНК А. Корнбергу, а за синтез РНК С. Очоа в 1959 г. была присуждена Нобелевская премия. )
Микросомы, рибосомы, трансляция
В середине 50-х годов считалось, что центром белкового синтеза в клетке являются микросомы. Термин микросомы был впервые введен в 1949 г. А. Клодом для обозначения фракции мелких гранул. Позднее выяснилось, что за белковый синтез ответственна не вся фракция микросом, состоящая из мембран и гранул, а только мелкие рибонуклеопротеидные частицы. Эти частицы в 1958 г. были названы Р. Робертсом рибосомами.
Классические исследования бактериальных рибосом были проведены А. Тисьером и Дж. Уотсоном в 1958 - 1959 гг. Бактериальные рибосомы оказались несколько мельче растительных и животных. Дж. Литлтон (1960), М. Кларк (1964) и Э. Н. Светайло (1966) показали, что рибосомы хлоропластов высших растений и митохондрий принадлежат к бактериальному типу. А. Тисьер и другие (1958) обнаружили, что рибосомы диссоциируют на две неравные субъединицы, содержащие по одной молекуле РНК. В конце 50-х годов считалось, что каждая молекула рибосомной РНК состоит из нескольких коротких фрагментов. Однако А. С. Спирин в 1960 г. впервые показал, что РНК в субчастицах представлены непрерывной молекулой. Д. Уоллер (1960), разделив рибосомные белки при помощи электрофореза в крахмальном геле, установил, что они весьма гетерогенны. Первое время многие сомневались в данных Уоллера, поскольку казалось, что белок рибосомы должен быть строго гомогенным, как, например, белок ВТМ. В настоящее время в результате исследований Д. Уоллера, Р. Траута, П. Трауба и других биохимиков стало известно, что в состав собственно рибосомных частиц входит более 50 совершенно различных по структуре белков. А. С. Спирину в 1963 г. удалось впервые развернуть рибосомные субчастицы и показать, что рибосомы представляют собой компактно скрученный рибонуклеопротеидный тяж, который в определенных условиях может развертываться. В 1967 - 1968 гг. М. Номура полностью реконструировал биологически активную субчастицу из рибосомной РНК и белка и даже получил такие рибосомы, в которых белок и РНК принадлежали разным микроорганизмам.
До сегодняшнего дня неясна роль рибосомной РНК. Предполагается, что она является той уникальной специфической матрицей, на которой при формировании рибосомной частицы находит строго определенное место каждый из многочисленных рибосомных белков (А. С. Спирин, 1968).
А. Рич (1962) обнаружил агрегаты из нескольких рибосом, соединенных между собой нитью иРНК. Эти комплексы были названы полисомами. Обнаружение полисом позволило Ричу и Уотсону (1963) высказать предположение, что синтез полипептидной цепи происходит на рибосоме, которая как бы продвигается по цепочке иРНК. По мере продвижения рибосомы по цепочке иРНК в частице совершается считывание информации и образование полипептидной цепи белка, а новые рибосомы поочередно присоединяются к высвобождающемуся прочитанному концу иРНК. Из данных Рича и Уотсона следовало, что значение полисом в клетке состоит в массовой продукции белка путем последовательного прочитывания матрицы сразу несколькими рибосомами.
В результате исследований М. Ниренберга, С. Очоа, Ф. Липмана, Г. Кораны и других в 1963 - 1970 гг. стало известно, что наряду с иРНК, рибосомами, АТФ и аминоацил-тРНК в процессе трансляции принимает участие большое количество разнообразных факторов, а сам процесс трансляции может быть условно разделен на три этапа - инициацию, собственно трансляцию и терминацию.
Инициация трансляции означает синтез первой пептидной связи в комплексе рибосома - матричный полинуклеотид - аминоацил-тРНК. Такой инициаторной активностью обладает не всякая аминоацил-тРНК, а формилметионил-тРНК. Это вещество было впервые выделено в 1964 г. Ф. Сенгером и К. Маркером. С. Бретчер и К. Маркер (1966) показали, что инициаторная функция формилметионил-тРНК обусловлена ее повышенным сродством к пептидильному центру рибосомы. Для начала трансляции крайне важны также некоторые белковые факторы инициации, которые были выделены в лабораториях С. Очоа, Ф. Гро и других иссследовательских центрах. После образования первой пептидной связи в рибосоме начинается собственно трансляция, т. е. последовательное присоединение аминоацильного остатка к С-концу полипептида. Многие детали процесса трансляции изучили К. Монро и Дж. Бишоп (Англия), И. Рыхлик и Ф. Шорм (ЧССР), Ф. Липман, М. Бретчер, В. Гилберт (США) и другие исследователи. В 1968 г. А. С. Спирин для объяснения механизма работы рибосомы предложил оригинальную гипотезу. Приводным механизмом, обеспечивающим все пространственные перемещения тРНК и иРНК во время трансляции, является периодическое размыкание и смыкание субчастиц рибосомы. Окончание трансляции закодировано в самой считываемой матрице, которая содержит терминирующие кодоны. Как показал С. Бреннер (1965 - 1967), такими кодонами являются триплеты УАА, УАГ и УГА. М. Капеччи (1967) выявил также специальные белковые факторы терминации. А. С. Спириным и Л. П. Гавриловой описан так называемый "неферментативный" синтез белка в рибосомах (1972 - 1975) без участия белковых факторов. Это открытие важно для понимания происхождения и эволюции биосинтеза белка.
Регуляция активности генов и белков
После проблемы специфичности белкового синтеза на первом месте в молекулярной биологии оказалась проблема регуляции синтеза белков, или, что то же самое, регуляции активности генов.
Функциональная неравнозначность клеток и связанные с ней репрессия и активация генов давно привлекали внимание генетиков, но до последнего времени реальный механизм контроля генной активности оставался неизвестным.
Первые попытки объяснить регуляторную активность генов были связаны с изучением гистонных белков. Еще супруги Стэдман * в начале 40-х годов XX в. высказывали мысль, что именно гистоны могут играть в этом явлении основную роль. В дальнейшем они получили первые четкие данные о различиях в химической природе гистонных белков. В настоящее время количество фактов, свидетельствующих в пользу этой гипотезы, с каждым годом все более возрастает.
* (Е. Stedman, E. Stedman. The basic proteins of cell nuclei.- Phylosoph. Trans. Roy. Soc. London, 1951, v. 235, 565 - 595. )
В то же время накапливается все большее число данных, говорящих о том, что регуляция генной активности - гораздо более сложный процесс, чем простое взаимодействие участков генов с молекулами гистонных белков. В 1960 - 1962 гг. в лаборатории Р. Б. Хесина-Лурье было выяснено, что гены фагов начинают считываться неодновременно: гены фага Т2 можно разделить на ранние, функционирование которых происходило в первые минуты заражения бактериальной клетки, и поздние, начинавшие синтезировать иРНК после завершения работы ранних генов.
В 1961 г. французские биохимики Ф. Жакоб и Ж. Моно предложили схему регуляции активности генов, которая сыграла исключительную роль в понимании регуляторных механизмов клетки вообще. Согласно схеме Жакоба и Моно, в ДНК кроме структурных (информационных) генов имеются еще гены-регуляторы и гены-операторы. Ген-регулятор кодирует синтез специфического вещества - репрессора, который может присоединяться как к индуктору, так и к гену-оператору. Ген-оператор сцеплен со структурными генами, а ген-регулятор находится на некотором отдалении от них. Если в среде нет индуктора, например, лактозы, то синтезируемый геном-регулятором репрессор связывается с геном-оператором и, блокируя его, выключает работу всего оперона (блок структурных генов вместе с управляющим ими оператором). Образования фермента в этих условиях не происходит. Если же в среде появляется индуктор (лактоза), то продукт гена-регулятора - репрессор - связывается с лактозой и снимает блок с гена-оператора. В этом случае становится возможной работа структурного гена, кодирующего синтез фермента, и фермент (лактоза) появляется в среде.
По мнению Жакоба и Моно, эта схема регуляции применима ко всем адаптивным ферментам и может иметь место как при репрессии, когда образование фермента подавляется избытком продукта реакции, так и при индукции, когда внесение субстрата вызывает синтез фермента. За исследования регуляции активности генов Жакоб и Моно были удостоены в 1965 г. Нобелевской премии.
Первоначально эта схема казалась слишком надуманной. Однако впоследствии выяснилось, что регуляция генов по этому принципу имеет место не только у бактерий, но и у других организмов.
Начиная с 1960 г. заметное место в молекулярной биологии занимают исследования организации генома и структуры хроматина у эукариотических организмов (Дж. Боннер, Р. Бриттен, В. Олфри, П. Уокер, Ю. С. Ченцов, И. Б. Збарский и др.) и по регуляции транскрипции (А. Мирский, Г. П. Георгиев, М. Бернстил, Д. Голл, Р. Цанев, Р. И. Салганик). Долгое время оставалась неизвестной и спорной природа репрессора. В 1968 г. М. Пташне (США) показал, что репрессором является белок. Он выделил его в лаборатории Дж. Уотсона и обнаружил, что репрессор, действительно, обладает сродством к индуктору (лактозе) и одновременно "узнает" ген-оператор лак-оперона и специфически связывается с ним.
В последние 5 - 7 лет получены данные о наличии еще одной управляющей ячейки генной активности - промоторе. Оказалось, что по соседству с операторным участком, к которому присоединяется продукт, синтезированный на гене-регуляторе - белковом веществе репрессора, имеется другой участок, который также следует отнести к членам регуляторной системы генной активности. К этому участку присоединяется белковая молекула фермента РНК-полимеразы. В промоторном участке должно произойти взаимное узнавание уникальной последовательности нуклеотидов в ДНК и специфической конфигурации белка РНК-полимеразы. От эффективности узнавания будет зависеть осуществление процесса считывания генетической информации с данной последовательностью генов оперона, примыкающего к промотору.
Кроме описанной Жакобом и Моно схемы, в клетке существуют и другие механизмы регуляции генов. Ф. Жакоб и С. Бреннер (1963) установили, что регуляция репликации бактериальной ДНК определенным образом контролируется клеточной мембраной. Опыты Жакоба (1954) по индукции разных профагов убедительно показали, что под влиянием различных мутагенных факторов в клетке лизогенных бактерий начинается избирательная репликация гена профага, а репликация генома хозяина блокируется. В 1970 г. Ф. Белл сообщил о том, что в цитоплазму из ядра могут переходить небольшие молекулы ДНК и уже там транскрибироваться.
Таким образом, регуляция активности генов может осуществляться на уровне репликации, транскрипции и трансляции.
Значительные успехи достигнуты в изучении регуляции не только синтеза ферментов, но и их активности. На явления регуляции активности ферментов в клетке указывали еще в 50-х годах А. Новик и Л. Сциллард. Г. Умбаргер (1956) установил, что в клетке существует весьма рациональный путь подавления активности фермента конечным продуктом цепи реакций по типу обратной связи. Как было установлено Ж. Моно, Ж. Шанже, Ф. Жакобом, А. Парди и другими исследователями (1956 - 1960), регуляция активности ферментов может осуществляться по аллостерическому принципу. Фермент или одна из его субъединиц, кроме сродства к субстрату, обладает сродством к одному из продуктов цепи реакций. Под влиянием такого продукта-сигнала фермент так изменяет свою конформацию, что утрачивает активность. В результате вся цепь ферментативных реакций выключается в самом начале. На существенную роль конформационных изменений белка в ферментативных реакциях, а в известном смысле и на наличие аллостерического эффекта, указывали Д. Уимен и Р. Вудворд (1952; лауреат Нобелевской премии, 1965).
Структура и функции белков
В результате работ Т. Осборна, Г. Гофмейстера, А. Гюрбера, Ф. Шульца и многих других в конце XIX в. были получены многие животные и растительные белки в кристаллическом виде. Примерно в это же время при помощи разных физических методов были установлены молекулярные веса некоторых белков. Так, в 1891 г. А. Сабанеев и Н. Александров сообщили, что молекулярный вес овальбумина составляет 14 000; в 1905 г. Э. Рейд установил, что молекулярный вес гемоглобина равен 48 000. Полимерная структура белков была раскрыта в 1871 г. Г. Глазиветцом и Д. Габерманом. Идея о пептидной связи отдельных аминокислотных остатков в белках была высказана Т. Куртиусом (1883). Работы по химической конденсации аминокислот (Э. Шаал, 1871; Г. Шифф, 1897; Л. Бальбиано и Д. Траскиатти, 1900) и синтезу гетерополипептидов (Э. Фишер, 1902 - 1907, Нобелевская премия, 1902) привели к разработке основных принципов химической структуры белков.
Первый кристаллический фермент (уреаза) был получен в 1926 г. Дж. Самнером (Нобелевская премия, 1946), а в 1930 г. Дж. Нортроп (Нобелевская премия, 1946) получил кристаллический пепсин. После этих работ стало ясно, что ферменты имеют белковую природу. В 1940 г. М. Куниц выделил кристаллическую РНК-азу. К 1958 г. уже было известно более 100 кристаллических ферментов и свыше 500 ферментов, выделенных в некристаллическом виде. Получение высокоочищенных препаратов индивидуальных белков способствовало расшифровке их первичной структуры и макромолекулярной организации.
Большое значение для развития молекулярной биологии вообще и генетики человека, в особенности, имело открытие Л. Полингом (1940) ненормального гемоглобина S, выделенного из эритроцитов людей с тяжелой наследственной болезнью - серповидно-клеточной анемией. В 1955 - 1957 гг. В. Ингрэм использовал разработанный Ф. Сенгером метод "отпечатков пальцев" (пятен, образуемых отдельными пептидами при хроматографии на бумаге) для анализа продуктов гидролиза гемоглобина S щелочью и трипсином. В 1961 г. Ингрэм сообщил, что гемоглобин S отличается от нормального гемоглобина только по природе одного аминокислотного остатка: в нормальном гемоглобине в седьмом положении цепи находится остаток глютаминовой кислоты, а в гемоглобине S - остаток валина. Тем самым полностью подтвердилось (1949) предположение Полинга, что серповидно-клеточная анемия является болезнью молекулярной природы. Наследуемое изменение всего одного остатка аминокислоты в каждой половинке макромолекулы гемоглобина приводит к тому, что гемоглобин утрачивает способность легко растворяться при низкой концентрации кислорода и начинает кристаллизоваться, что приводит к нарушению структуры клетки. Эти исследования со всей очевидностью показали, что структура белка представляет собой строго определенную аминокислотную последовательность, которая закодирована в геноме. Об исключительном значении первичной структуры белка в формировании уникальной биологически активной конформации макромолекулы свидетельствовали работы К. Анфинсена (1951). Анфинсен показал, что утрачиваемая в результате восстановления биологически активная макроструктура панкреатической рибонуклеазы предопределена аминокислотной последовательностью и может вновь возникать спонтанно при окислении SH-групп остатков цистеина с образованием дисульфидных сшивок в строго определенных местах пептидной цепи фермента.
К настоящему времени детально изучен механизм действия большого числа ферментов и определена структура многих белков.
В 1953 г. Ф. Сенгер установил аминокислотную последовательность инсулина. :Этот белок состоит из двух полипептидных цепей, соединенных двумя дисульфидными сшивками. Одна из цепей содержит всего 21 аминокислотный остаток, а другая - 30 остатков. На расшифровку строения этого сравнительно простого белка Сенгер потратил около 10 лет. В 1958 г. за это выдающееся исследование ему была присуждена Нобелевская премия. После создания В. Стейном и С. Муром (1957) автоматического анализатора аминокислот, идентификация продуктов частичного гидролиза белков значительно ускорилась. В 1960 г. Стейн и Мур уже сообщили о том. что им удалось определить последовательность рибонуклеазы, пептидная цепочка которой представлена 124 аминокислотными остатками. В том же году в лаборатории Г. Шрамма в Тюбингене (ФРГ) Ф. Андерер и другие определили аминокислотную последовательность в белке ВТМ. Затем аминокислотная последовательность была определена в миоглобине (А. Эдмунсон) и α- и β-цепях гемоглобина человека (Г. Браунитцер, Э. Шредер и др.), лизоциме из белка куриного яйца (Ж. Жолле, Д. Кейфилд). В 1963 г. Ф. Шорм и Б. Кейл (ЧССР) установили последовательность аминокислот в молекуле химотрипсиногена. В том же году была определена аминокислотная последовательность трипсиногена (Ф. Шорм, Д. Уолш). В 1965 г. К. Такахаши установил первичную структуру рибонуклеазы T1. Затем последовательность аминокислот была определена еще у нескольких белков.
Как известно, окончательным доказательством правильности определения той или иной структуры является ее синтез. В 1969 г. Р. Мерифилд (США) впервые осуществил химический синтез панкреатической рибонуклеазы. При помощи разработанного им метода синтеза на твердофазовом носителе Мерифилд присоединял к цепочке одну аминокислоту за другой в соответствии с той последовательностью, которая была описана Стейном и Муром. В результате он получил белок, который по своим качествам был идентичен панкреатической рибонуклеазе А. За раскрытие строения рибонуклеазы В. Стейну, С. Муру и К. Анфинсену была в 1972 г. присуждена Нобелевская премия. Этот синтез природного белка открывает грандиозные перспективы, указывая на возможность создания любых белков в соответствии с заранее запланированной последовательностью.
Из рентгеноструктурных исследований У. Астбери (1933) следовало, что пептидные цепи белковых молекул скручены или уложены каким-то строго определенным образом. Начиная с этого времени, многие авторы высказывали различные гипотезы о способах укладки белковых цепей, но до 1951 г. все модели оставались умозрительными построениями, не отвечавшими экспериментальным данным. В 1951 г. Л. Полинг и Р. Кори опубликовали серию блестящих работ, в которых окончательно была сформулирована теория вторичной структуры белков - теория α-спирали. Наряду с этим стало также известно, что белки обладают еще третичной структурой: α-спираль пептидной цепи может быть определенным образом сложена, образуя довольно компактную структуру.
В 1957 г. Дж. Кендрю и его сотрудники впервые предложили трехмерную модель структуры миоглобина. Эта модель затем уточнялась в течение нескольких лет, пока в 1961 г. не появилась итоговая работа с характеристикой пространственной структуры этого белка. В 1959 г. М. Перутц и сотрудники установили трехмерную структуру гемоглобина. На эту работу исследователи затратили более 20 лет (первые рентгенограммы гемоглобина были получены Перутцем в 1937 г.). Поскольку молекула гемоглобина состоит из четырех субъединиц, то, расшифровав его организацию, Перутц тем самым впервые описал четвертичную структуру белка. За работы по определению трехмерной структуры белков Кендрю и Перутцу в 1962 г. была присуждена Нобелевская премия.
Создание Перутцем пространственной модели структуры гемоглобина ПОЗВОЛИЛО. приблизиться к пониманию механизма функционирования этого белка, который, как известно, осуществляет перенос кислорода в животных клетках. Еще в 1937 г. Ф. Гауровиц пришел к выводу о том, что взаимодействие гемоглобина с кислородом, воздуха должно сопровождаться изменением структуры белка. В 60-х годах Перутц и его сотрудники обнаружили заметное смещение цепей гемоглобина после его окисления, вызывавшееся сдвигом атомов железа в результате связывания с кислородом. На этой основе сформировались представления о "дыхании" белковых макромолекул.
В 1960 г. Д. Филлипс и его сотрудники начали рентгеноструктурные исследования молекулы лизоцима. К 1967 г. им более или менее точно удалось установить детали организации этого белка и локализацию отдельных атомов в его молекуле. Кроме этого, Филлипс выяснил характер присоединения лизоцима к субстрату (триацетилглюкозамину). Это позволило воссоздать механизм работы этого фермента. Таким образом, знание первичной структуры и макромолекулярной организации дало возможность не только установить природу активных центров многих ферментов, но и полностью раскрыть механизм функционирования этих макромолекул.
Использование методов электронной микроскопии помогло раскрыть принципы макромолекулярной организации таких сложных белковых образований, как нити коллагена, фибриногена, сократительных фибрилл мышц и др. В конце 50-х годов были предложены модели мышечного сократительного аппарата. Исключительное значение для понимания механизма мышечного сокращения имело открытие В. А. Энгельгардтом и М. Н. Любимовой (1939) АТФ-азной активности миозина. Это означало, что в основе акта мышечного сокращения лежит изменение физико-химических свойств и макромолекулярной организации сократительного белка под влиянием аденозинтрифосфорной кислоты (см. также главу 11).
Для понимания принципов сборки биологических структур существенное значение имели вирусологические исследования (см. главу 25).
Нерешенные проблемы
Основные успехи в современной молекулярной биологии достигнуты в основном в результате изучения нуклеиновых кислот. Тем не менее даже в этой области еще далеко не все проблемы разрешены. Больших усилий потребует, в частности, расшифровка всей нуклеотидной последовательности генома. Эта проблема в свою очередь неразрывно связана с проблемой гетерогенности ДНК и требует разработки новых совершенных методов фракционирования и выделения индивидуальных молекул из суммарного генетического материала клетки.
До сих пор усилия в основном были сосредоточены на раздельном изучении белков и нуклеиновых кислот. В клетке же эти биополимеры неразрывно связаны друг с другом и функционируют главным образом в форме нуклеопротеидов. Поэтому сейчас с особой остротой проявилась необходимость изучения взаимодействия белков и нуклеиновых кислот. На первый план выдвигается проблема узнавания белками определенных участков нуклеиновых кислот. Уже наметились шаги к изучению такого взаимодействия этих биополимеров, без которого немыслимо полное понимание структуры и функций хромосом, рибосом и других структур. Без этого невозможно также уяснить регуляцию активности генов и окончательно расшифровать принципы работы белоксинтезирующих механизмов. После работ Жакоба и Моно появились некоторые новые данные о регуляторном значении мембран в синтезе ядерного материала. Это ставит задачу более глубокого исследования роли мембран в регуляции репликации ДНК. В целом проблема регуляции активности генов и клеточной активности вообще стала одной из важнейших проблем современной молекулярной биологии.
Современное состояние биофизики
В тесной связи с проблемами молекулярной биологии шло развитие биофизики. Интерес к этой области биологии стимулировался, с одной стороны, необходимостью всестороннего изучения действия на организм различного рода излучений, с другой - потребностью исследования физических и физико-химических основ жизненных явлений, протекающих на молекулярном уровне.
Получение точных сведений о молекулярных структурах и совершающихся в них процессах стало возможным в результате применения новых тонких физико-химических методов. На основе достижений электрохимии удалось усовершенствовать метод измерения биоэлектрических потенциалов, применив ионно-избирательные электроды (Г. Эйзенман, Б. П. Никольский, Кхури, 50 - 60-е годы). Все шире входит в практику инфракрасная спектроскопия (с использованием лазерных устройств), позволяющая исследовать конформационные изменения белков (И. Плотников, 1940). Ценные сведения дает также метод электронного парамагнитного резонанса (Е. К. Завойский, 1944) и биохемолюминесцентный метод (Б. Н. Тарусов и др., 1960), которые позволяют, в частности, судить о транспорте электронов при окислительных процессах.
К 50-м годам биофизика завоевывает уже прочное положение. Возникает потребность в подготовке квалифицированных специалистов. Если в 1911 г. в Европе только в университете г. Печ, в Венгрии, была кафедра биофизики, то к 1973 г. такие кафедры существуют почти во всех крупных университетах.
В 1960 г. было организовано Международное общество биофизиков. В августе 1961 г. состоялся первый Международный биофизический конгресс в Стокгольме. Второй конгресс был проведен в 1965 г. в Париже, третий - в 1969 г. в Бостоне, четвертый - в 1972 г. в Москве.
В биофизике сохраняется четкое разграничение между двумя различными по содержанию направлениями - молекулярной биофизикой и клеточной биофизикой. Это разграничение получает и организационное выражение: создаются раздельные кафедры этих двух направлений биофизики. В Московском университете первая кафедра биофизики была создана в 1953 г. на биолого-почвенном факультете, несколько позже возникла кафедра биофизики на физическом факультете. По такому же принципу организовывались кафедры во многих других университетах.
Молекулярная биофизика
В последние годы все больше укреплялась связь молекулярной биофизики с молекулярной биологией, и сейчас бывает иногда трудно определить, где проходит граница раздела между ними. В генеральном наступлении на проблему наследственной информации такая кооперация биофизики с молекулярной биологией неизбежна.
Главным направлением в исследовательской работе является изучение физики нуклеиновых кислот - ДНК и РНК. Применение указанных выше методов и прежде всего рентгеноструктурного анализа способствовало расшифровке молекулярной структуры нуклеиновых кислот. В настоящее время ведутся интенсивные исследования по изучению поведения этих кислот в растворах. Особое внимание уделяется при этом конформационным переходам "спираль-клубок", изучаемым по изменениям вязкости, оптическим и электрическим показателям. В связи с изучением механизмов мутагенеза развиваются исследования по изучению действия ионизирующей радиации на поведение нуклеиновых кислот в растворах, а также действия радиации на нуклеиновые кислоты вирусов и фагов. Всестороннему анализу подвергалось влияние ультрафиолетового излучения, некоторые спектральные участки которого, как известно, хорошо поглощаются нуклеиновыми кислотами. Большой удельный вес в такого рода исследованиях занимает обнаружение активных радикалов нуклеиновых кислот и белков методом электронного парамагнитного резонанса. С применением этого метода связано возникновение целого самостоятельного направления.
Проблема кодирования информации ДНК и РНК и ее передачи при синтезе белка давно интересовала молекулярную биофизику, и физики неоднократно высказывали по этому поводу те или иные соображения (Э. Шредингер, Г. Гамов). Расшифровка генетического кода вызвала многочисленные теоретические и экспериментальные исследования по структуре спирали ДНК, механизму скольжения и закручивания ее нитей, по изучению физических сил, участвующих в данных процессах.
Значительную помощь молекулярная биофизика оказывает молекулярной биологии в изучении структуры белковых молекул при помощи рентгеноструктурного анализа, впервые примененного в 1930 г. Дж. Берналом. Именно в результате использования физических методов в сочетании с биохимическими (ферментативные методы) была вскрыта молекулярная конформация и последовательность расположения аминокислот в ряде белков.
Современные электронно-микроскопические исследования, выявившие наличие в клетках и ее органоидах сложных мембранных систем, стимулировали попытки понять их молекулярное строение (см. главы 10 и 11). Изучается прижизненно химический состав мембран и, в частности, свойства их липидов. Было выяснено, что последние способны к переокислению и неферментативным реакциям цепного окисления (Ю. А. Владимиров и Ф. Ф. Литвин, 1959; Б. Н. Тарусов и др., 1960; И. И. Иванов, 1967), приводящим к нарушению мембранных функций. Для изучения состава мембран стали пользоваться также методами математического моделирования (В. Ц. Пресман, 1964 - 1968; М. М. Шемякин, 1967; Ю. А. Овчинников, 1972).
Клеточная биофизика
Знаменательным событием в истории биофизики явилось формирование в 50-х годах четких представлений о термодинамике биологических процессов, в результате чего окончательно отпали предположения о возможности самостоятельного образования энергии в живых клетках вопреки второму закону термодинамики. Понимание действия этого закона в биологических системах связано с введением бельгийским ученым И. Пригожиным (1945) * в биологическую термодинамику понятия открытых систем, обменивающихся с внешней средой энергией и материей. Пригожин показал, что положительная энтропия образуется в живых клетках при рабочих процессах соответственно второму закону термодинамики. Введенные им уравнения определили условия, при которых возникает так называемое стационарное состояние (ранее его именовали также динамическим равновесием), при котором количество свободной энергии (негэнтропии), поступающей в клетки с пищей, компенсирует ее расход, а положительная энтропия выводится. Это открытие подкрепило общебиологическую идею о неразрывной связи внешней и внутренней среды клеток. Оно положило начало реальному изучению термодинамики живы" систем, в том числе методом моделирования (А. Бэртон, 1939; А. Г. Пасынский, 1967).
* (Общую теорию открытых систем впервые выдвинул Л. Берталанфи в 1932 г. )
Согласно основному принципу биотермодинамики, необходимым условием существования жизни оказывается стационарность в развитии ее биохимических процессов, для осуществления которой необходима координация скоростей многочисленных реакций обмена веществ. На основе новой биофизической термодинамики возникло направление, выделяющее внешние и внутренние факторы, которые обеспечивают эту координацию реакций и делают ее устойчивой. За последние два десятилетия выявлена большая роль в поддержании стационарного состояния системы ингибиторов и особенно антиоксидантов (Б. Н. Тарусов и А. И. Журавлев, 1954, 1958). Установлено, что надежность стационарного развития связана с факторами внешней среды (температурой) и физико-химическими свойствами среды клеток.
Современные принципы биотермодинамики позволили дать физико-химическое истолкование механизму адаптации. По нашим данным, приспособление к условиям внешней среды может происходить только в том случае, если при их изменении организм способен установить стационарность в развитии биохимических реакций (Б. Н. Тарусов, 1974). Встал вопрос о разработке новых методов, которые позволили бы оценивать стационарное состояние прижизненно и прогнозировать его возможные нарушения. Большую пользу сулит внедрение в биотермодинамику и исследования процессов биологической адаптации кибернетических принципов саморегулирующихся систем. Стало ясно, что для решения вопроса об устойчивости стационарного состояния важен учет так называемых возмущающих факторов, к которым относятся, в частности, неферментативные реакции окисления липидов. В последнее время все более расширяются исследования процессов переокисления в липидных фазах живых клеток и нарастания активных радикальных продуктов, нарушающих регуляторные функции мембран. Источником информации об этих процессах служит как обнаружение активных перекисных радикалов, так и перекисных соединений биолипидов (А. Таппель, 1965; И. И. Иванов, 1965; Е. Б. Бурлакова, 1967 и другие). Для обнаружения радикалов используют биохемолюминесценцию, возникающую в липидах живых клеток при их рекомбинации.
На основе физико-химических представлений о стабильности стационарного состояния возникли биофизические представления об адаптации растений к изменениям условий внешней среды как нарушении ингибирующих антиокислительных систем (Б. Н. Тарусов, Я. Е. Доскоч, Б. М. Китлаев, А. М. Агавердиев, 1968 - 1972). Это открыло возможность оценивать такие свойства, как морозоустойчивость и солеустойчивость, а также делать соответствующие прогнозы при селекции сельскохозяйственных растений.
В 50-х годах было открыто сверхслабое свечение - биохемолюминесценция ряда биологических объектов в видимой и инфракрасной частях спектра (Б. Н. Тарусов, А. И. Журавлев, А. И. Поливода). Это стало возможным в результате разработки методов регистрации сверхслабых световых потоков при помощи фотоэлектронных умножителей (Л. А. Кубецкий, 1934). Являясь результатом биохимических реакций, протекающих в живой клетке, биохемолюминесценция позволяет судить о важных окислительных процессах в цепях переноса электронов между ферментами. Открытие и изучение биохемолюминесценции имеет большое теоретическое и практическое значение. Так, Б. Н. Тарусов и Ю. Б. Кудряшов отмечают большую роль продуктов окисления ненасыщенных жирных кислот в механизме возникновения патологических состояний, развивающихся под действием ионизирующих излучений, при канцерогенезе и других нарушениях нормальных функций клетки.
В 50-х годах в связи с бурным развитием ядерной физики из биофизики выделилась радиобиология, исследующая биологическое действие ионизирующих излучений. Получение искусственных радиоактивных изотопов, создание термоядерного оружия, атомных реакторов и развитие других форм практического использования атомной энергии поставило со всей остротой проблему защиты организмов от вредного действия ионизирующей радиации, разработки теоретических основ профилактики и лечения лучевой болезни. Для этого необходимо было в первую очередь выяснить, какие компоненты клетки и звенья обмена веществ наиболее уязвимы.
Объектом изучения биофизики и радиобиологии стало выяснение природы первичных химических реакций, возникающих в живых субстратах под воздействием энергии излучений. Здесь было важно не только понять механизмы этого явления, но и суметь воздействовать на процесс размена физической энергии на химическую, уменьшить его коэффициент "полезного" действия. Работам в этом направлении положили начало исследования школы Н. Н. Семенова (1933) в СССР и Д. Хиншельвуда (1935) в Англии.
Большое место в радиобиологических исследованиях заняло изучение степени радиационной сопротивляемости различных организмов. Было установлено, что повышенная радиорезистентность (например, грызунов пустынь) обусловлена высокой антиокислительной активностью липидов клеточных мембран (М. Чанг и др., 1964; Н. К. Огрызов и др., 1969). Оказалось, что в формировании антиоксидативных свойств этих систем большую роль играют токоферолы, витамин К и тиосоединения (И. И. Иванов и др., 1972). В последние годы большое внимание привлекают к себе также исследования механизмов мутагенеза. С этой целью изучается действие ионизирующих излучений на поведение нуклеиновых кислот и белков in vitro, а также в вирусах и фагах (А. Густафсон, 1945 - 1950).
Борьба за дальнейшее повышение эффективности химической защиты, поиск более эффективных ингибиторов и принципов ингибирования остаются в этом направлении основными задачами биофизики.
Продвинулось вперед исследование возбужденных состояний биополимеров, определяющих их высокую химическую активность. Наиболее успешно шло изучение возбужденных состояний, возникающих на первичной стадии фотобиологических процессов - фотосинтеза и зрения.
Так, сделан солидный вклад в понимание первичной активации молекул пигментных систем растений. Установлено большое значение переброски (миграции) энергии возбужденных состояний без потерь с активированных пигментов на другие субстраты. Большую роль в развитии этих представлений сыграли теоретические работы А. Н. Теренина (1947 и позднее). А. А. Красновский (1949) открыл и исследовал реакцию обратимого фотохимического восстановления хлорофилла и его аналогов. Ныне складывается всеобщее убеждение, что в ближайшем будущем можно будет воспроизвести фотосинтез в искусственных условиях (см. также главу 5).
Биофизики продолжают работать над раскрытием природы мышечного сокращения и механизмов нервного возбуждения и проведения (см. главу 11). Актуальное значение приобрели также исследования механизмов перехода от возбужденного состояния к норме. Возбужденное состояние рассматривают теперь как результат автокаталитической реакции, а торможение - как следствие резкой мобилизации ингибиторной антиокислительной активности в результате молекулярных перегруппировок в таких соединениях, как токоферол (И. И. Иванов, О. Р. Кольс, 1966; О. Р. Кольс, 1970).
Важнейшей общей проблемой биофизики остается познание качественных физико-химических особенностей живой материи. Такие свойства, как способность живых биополимеров избирательно связывать калий или поляризовать электрический ток, не удается сохранить даже при их самом осторожном извлечении из организма. Поэтому клеточная биофизика продолжает интенсивно разрабатывать критерии и методы для прижизненного исследования живой материи.
Несмотря на молодость молекулярной биологии, успехи, достигнутые ею в этой области, поистине ошеломляющи. За сравнительно короткий срок установлена природа гена и основные принципы его организации, воспроизведения и функционирования. Более того, осуществлено не только размножение генов in vitro, но и впервые завершен полный синтез самого гена. Полностью расшифрован генетический код и разрешена важнейшая биологическая проблема специфичности биосинтеза белка. Выявлены и исследованы главные пути и механизмы образования белка в клетке. Полностью определена первичная структура многих транспортных РНК - специфических молекул-адапторов, осуществляющих перевод языка нуклеиновых матриц на язык аминокислотной последовательности синтезирующегося белка. До конца расшифрована аминокислотная последовательность многих белков и установлена пространственная структура некоторых из них. Это дало возможность выяснять принцип и детали функционирования молекул ферментов. Осуществлен химический синтез одного из ферментов - рибонуклеазы. Установлены основные принципы организации разных субклеточных частиц, многих вирусов и фагов и разгаданы основные пути их биогенеза в клетке. Вскрыты подходы к пониманию путей регуляции активности генов и выяснению регуляторных механизмов жизнедеятельности. Уже простой перечень этих открытий свидетельствует о том, что вторая половина XX в. ознаменовалась огромным прогрессом биологии, который обязан прежде всего углубленному изучению структуры и функций биологически важнейших макромолекул - нуклеиновых кислот и белков.
Достижения молекулярной биологии уже сегодня используются на практике и приносят ощутимые плоды в медицине, сельском хозяйстве и некоторых отраслях промышленности. Несомненно, что отдача этой науки будет возрастать с каждым днем. Однако главным итогом все же следует считать, что под влиянием успехов молекулярной биологии укрепилась уверенность в существовании неограниченных возможностей на пути раскрытия самых сокровенных тайн жизни.
В будущем, по-видимому, будут открыты новые пути исследования биологической формы движения материи - с молекулярного уровня биология перейдет на атомарный уровень. Однако сейчас не найдется, пожалуй, ни одного исследователя, который мог бы достаточно реально предсказать развитие молекулярной биологии даже на ближайшие 20 лет.
Успехи в изучении нуклеиновых кислот и биосинтеза белка привели к созданию ряда методов, имеющих большое прикладное значение в медицине, сельском хозяйстве и ряде других отраслей.
После того, как был изучен генетический код и основные принципы хранения и реализации наследственной информации, развитие молекулярной биологии зашло в тупик, так как не было методов, которые позволяли манипулировать генами, выделять и изменять их. Появление этих методов произошло в 1970-1980х годах. Это дало мощный толчок развитию этой области науки, которая и сегодня переживает период расцвета. Прежде всего, эти методы касаются получения индивидуальных генов и их введения в клетки других организмов (молекулярное клонирование и трансгенез, ПЦР), а также методов определения последовательности нуклеотидов в генах (секвенирования ДНК и РНК). Ниже эти методы будут рассмотрены более подробно. Мы начнем с простейшего базового метода - электрофореза и затем перейдем к более сложным методам.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК
Это базовый метод работы с ДНК, применяющийся вместе с практическими всеми другими методами для выделения нужных молекул и анализа результатов. Для разделения фрагментов ДНК по длине применяется метод электрофореза в геле. ДНК - кислота, ее молекулы содержат остатки фосфорной кислоты, которые отщепляют протон и приобретают отрицательный заряд (рис. 1).
Поэтому в электрическом поле молекулы ДНК движутся к аноду - положительно заряженному электроду. Это происходит в растворе электролитов, содержащем ионы-носители заряда, благодаря чему этот раствор проводит ток. Чтобы разделить фрагменты, применяется плотный гель из полимеров (агарозы либо полиакриламида). Молекулы ДНК "запутываются" в нем тем больше, чем они длиннее, и поэтому наиболее длинные молекулы движутся медленнее всего, а наиболее короткие - быстрее всего (рис. 2). Заблаговременно или после электрофореза гель обрабатывают красителями, связывающимися с ДНК и флуоресцирующими в ультрафиолетовом свете, и получают картину полос в геле (см. рис. 3). Для определения длин фрагментов ДНК образца их сравнивают с маркером - набором фрагментов стандартных длин, нанесенных параллельно на тот же гель (рис. 4).
Важнейшими инструментами для работы с ДНК являются ферменты, осуществляющие превращения ДНК в живых клетках: ДНК-полимеразы, ДНК-лигазы и рестрикционные эндонуклеазы, или рестриктазы. ДНК-полимеразы осуществляют матричный синтез ДНК, что позволяет размножать ДНК в пробирке. ДНК-лигазы сшивают между собой молекулы ДНК или залечивают бреши них. Рестрикционные эндонуклеазы , или рестриктазы , разрезают молекулы ДНК по строго определённым последовательностям, что позволяет вырезать отдельные фрагменты из общей массы ДНК. Эти фрагменты могут в каких-то случаях содержать отдельные гены.
рестриктазы
Последовательности, узнаваемые рестриктазами, симметричны, и разрывы могут происходить в середине такой последовательности или со сдвигом (в одном и том же месте в обеих нитях ДНК). Схема действия разных типов рестриктаз показана на рис. 1. В первом случае получаются так называемые «тупые» концы, а во втором – «липкие» концы. В случае «липких» концов дна цепь оказывается короче другой, образуется однонитевой участок с симметричной последовательностью, одинаковой на обоих образующихся концах.
Концевые последовательности будут одинаковыми при расщеплении любой ДНК данной рестриктазой и могут снова соединяться, так как имеют комплементарные последовательности. Их можно сшить с помощью ДНК-лигазы и получить единую молекулу. Таким образом удаётся объединить фрагменты двух разных ДНК и получить так называемые рекомбинантные ДНК . Этот подход используется в методе молекулярного клонирования, позволяющего получить индивидуальные гены и ввести их в клетки, которые могут образовывать закодированный в гене белок.
молекулярное клонирование
В молекулярном клонировании используется две молекулы ДНК - вставка, содержащая интересующий ген, и вектор - ДНК, выступающая в роли носителя. Вставку "вшивают" в вектор пр помощи ферментов, получая новую, рекомбинантную молекулу ДНК, затем эту молекулу внедряют в клетки-хозяева, и эти клетки образуют колонии на питательной среде. Колония - это потомство одной клетки, то есть клон, все клетки колонии генетически идентичны и содержат одну и ту же рекомбинантную ДНК. Отсюда термин "молекулярное клонирование", то есть получение клона клеток, содержащих интересующий нас фрагмент ДНК. После того, как колонии, содержащие интересующую нас вставку, получены, можно различными методами характеризовать эту вставку, например, определить ее точную последовательность. Также клетки могут производить кодируемый вставкой белок, если она содержит функциональный ген.
При внедрении рекомбинантной молекулы в клетки происходит генетическая трансформация этих клеток. Трансформация - процесс поглощения клеткой организма свободной молекулы ДНК из среды и встраивания её в геном, что приводит к появлению у такой клетки новых для неё наследуемых признаков, характерных для организма-донора ДНК. Например, если встраиваемая молекула содержит ген устойчивости к антибиотику ампициллину, то трансформированные бактерии будут расти в его присутствии. До трансформации ампициллин вызывал их гибель, то есть у трансформированных клеток возникает новый признак.
ВЕКТОРЫ
Вектор должен обладать рядом свойств:
Во-первых, это относительно небольшая молекула ДНК, чтобы ей было легко манипулировать.
Во-вторых, для того, чтобы ДНК сохранялась и размножалась в клетке, она должна содержать определённую последовательность, обеспечивающую её репликацию (точку начала репликации, или origin of replication).
В-третьих, она должна содержать ген-маркер , который обеспечивает отбор только тех клеток, в которые попал вектор. Обычно это гены устойчивости к антибиотикам - тогда в присутствии антибиотика все не содержащие вектора клетки погибают.
Клонирование генов чаще всего проводят в клетках бактерий, так как они просты в культивировании и быстро размножаются. В клетке бактерии обычно присутствует одна большая кольцевая молекула ДНК, длиной в несколько миллионов пар нуклеотидов, содержащая все необходимые бактерии гены - бактериальная хромосома. Кроме неё в некоторых бактериях существуют небольшие (несколько тысяч пар нуклеотидов) кольцевые ДНК, называемые плазмидами (рис. 2). Они, также как и основная ДНК, содержат последовательность нуклеотидов, обеспечивающую способность ДНК реплицироваться (ori). Плазмиды реплицируются независимо от основной (хромосомной) ДНК, поэтому присутствуют в клетке в большом количестве копий. Многие из таких плазмид несут гены устойчивости к антибиотикам, что позволяет отличить клетки, несущие плазмиду, от обычных клеток. Чаще используются плазмиды, несущие два гена, обеспечивающие устойчивость к двум антибиотикам, например, к тетрациклину и апмицилину. Существуют простые методы выделения таких плазмидных ДНК, свободных от ДНК основной хромосомы бактерии.
ЗНАЧЕНИЕ ТРАНСГЕНЕЗА
Перенос генов из одного организма в другой называют трансгенезом , а такие модифицированные организмы - трансгенными . Методом переноса генов в клетки микроорганизмов получают рекомбинантные белковые препараты для нужд медицины, в частности, человеческие белки, не вызывающие иммунного отторжения - интерфероны, инсулин и другие белковые гормоны, клеточные факторы роста, а также белки для производства вакцин. В более сложных случаях, когда модификация белков проходит правильно только в клетках эукариот, применяют трансгенные клеточные культуры или трансгенных животных, в частности, скот (прежде всего коз), который выделяет необходимые белки в молоко, или же белки выделяют из их крови. Так получают антитела, факторы свертывания крови и другие белки. Методом трансгенеза получают культурные растения, устойчивые к гербицидам и вредителям и обладающие другими полезными свойствами. При помощью трансгенных микроорганизмов очищают сточные воды и борются с загрязнениями, существуют даже трансгенные микробы, которые могут расщеплять нефть. Помимо этого, трансгенные технологии незаменимы в научных исследованиях - развитие биологии сегодня немыслимо без рутинного применения методов модификации и переноса генов.
технология молекулярного клонирования
вставки
Для получения индивидуального гена из какого-либо организма из него выделяют всю хромосомную ДНК и расщепляют её одной или двумя рестриктазами. Ферменты подбирают так, чтобы они не разрезали интересующий нас ген, а делали разрывы по его краям, а в плазмидной ДНК делали 1 разрыв в одном из генов устойчивости, например, к ампицилину.
Процесс молекулярного клонирования включает следующие этапы:
Разрезание и сшивание - конструирование из вставки и вектора единой рекомбинантной молекулы.
Трансформация - внедрение рекомбинантной молекулы в клетки.
Селекция - отбор клеток, получивших вектор со вставкой.
разрезание и сшивание
Плазмидную ДНК обрабатывают теми же рестриктазами, и она превращается в линейную молекулу, если подобрана такая рестриктаза, которая вносит в плазмиду 1 разрыв. В результате на концах всех образующихся фрагментов ДНК оказываются одни и те же липкие концы. При понижении температуры эти концы соединяются случайным образом, и их сшивают ДНК-лигазой (см. рис. 3).
Получают смесь кольцевых ДНК разного состава: некоторые из них будут содержать определённую последовательность ДНК хромосомной ДНК, соединённую с бактериальной ДНК, другие – соединённые вместе фрагменты хромосомной ДНК, а третьи – восстановленную кольцевую плазмиду или её димер (Рис. 4).
трансформация
Далее этой смесью проводят генетическую трансформацию бактерий, не содержащих плазмиды. Трансформация - процесс поглощения клеткой организма свободной молекулы ДНК из среды и встраивания её в геном, что приводит к появлению у такой клетки новых для неё наследуемых признаков, характерных для организма-донора ДНК. В каждую клетку может проникнуть и размножиться там только одна плазмида. Такие клетки помещают на твёрдую питательную среду, в которой содержится антибиотик тетрациклин. Клетки, в которые не попала плазмида, на этой среде расти не будут, а клетки, несущие плазмиду, образуют колонии, в каждой из которых находятся потомки только одной клетки, т.е. все клетки в колонии несут одну и ту же плазмиду (см. рис. 5).
Селекция
Далее стоит задача выделить только клетки, в которые попал вектор со вставкой, и отличить их от клеток, несущих только вектор без вставки или вовсе не несущих вектора. Этот процесс отбора нужных клеток называется селекцией . Для этого применяют селективные маркеры - обычно гены устойчивости к антибиотикам в составе вектора, и селективные среды , содержащие антибиотики или другие вещества, обеспечивающие селекцию.
В рассматриваемом нами примере клетки из колоний, выросших в присутствии ампицилина, пересевают на две среды: в первой есть ампицилин, а во второй – тетрациклин. Колонии, содержащие только плазмиду, вырастут на обеих средах, а колонии, в плазмидах которых находится встроенная хромосомная ДНК на среде с тетрациклином не вырастут (рис. 5). Среди них специальными методами отбирают те, которые содержат интересующий нас ген, выращивают в достаточных количествах и выделяют плазмидную ДНК. Из неё с помощью тех же рестриктаз, которые использовались при получении рекомбинантной ДНК, вырезают интересующий индивидуальный ген. ДНК этого гена может использоваться для определения последовательности нуклеотидов, введения в какой либо организм для получения новых свойств или синтеза нужного белка. Такой метод выделения генов называется молекулярным клонированием .
ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ БЕЛКИ
В качестве генов-маркеров при исследованиях эукариотических организмов очень удобно использовать флуоресцентные белки. Ген первого флуоресцентного белка, зеленого флуоресцирующего белка (green fluorescent protein, GFP) был выделен из медузы Aqeuorea victoria и внедрен в различные модельные организмы (см. рис. 6) В 2008 году О. Симомура, М. Чалфи и Р. Тсьен получили Нобелевскую премию за открытие и применение этого белка.
Затем были выделены гены других флуоресцентных белков - красного, синего, желтого. Эти гены были модифицированы искусственно, чтобы получить белки с нужными свойствами. Разнообразие флуоресцентных белков показано на рис. 7, где изображена чашка Петри с бактериями, содержащими гены различных флуоресцентных белков.
применение флуоресцентных белков
Ген флуоресцентного белка можно сшивать с геном любого другого белка, тогда при трансляции будет образовываться единый белок - трансляционно слитый белок, или фьюжн (fusion protein), который флуоресцирует. Таким образом можно изучать, например, локализацию (расположение) любых интересующих белков в клетке, их перемещение. При помощи экспрессии флуоресцентных белков только в определенных типах клеток можно помечать клетки этих типов в многоклеточном организме (см. рис. 8 - мозг мыши, в котором отдельные нейроны имеют разные цвета за счет определенной комбинации генов флуоресцентных белков). Флуоресцентные белки - незаменимый инструмент современной молекулярной биологии.
ПЦР
Еще один метод получения генов называется полимеразной цепной реакцией (ПЦР) . В его основе лежит способность ДНК-полимераз достраивать вторую нить ДНК по комплементарной нити, как это происходит в клетках при репликации ДНК.
Точки начала репликации в этом методе задаются двумя небольшими фрагментами ДНК, называемыми затравками,
или праймерами
. Эти затравки комплементарны концам интересующего гена на двух цепях ДНК. Сначала хромосомную ДНК, из которой надо выделить ген, смешивают с затравками и нагревают до 99 о С. Это приводит к разрыву водородных связей и расхождению нитей ДНК. После этого температуру понижают до50-70 о С (в зависимости от длины и последовательности затравок). В этих условиях затравки присоединяются к комплементарным участкам хромосомной ДНК, образуя правильную двойную спираль (см. рис. 9). После этого добавляют смесь всех четырёх нуклеотидов, нужных для синтеза ДНК, и ДНК-полимеразу. Фермент удлиняет затравки, строя двуспиральную ДНК от места прикрепления затравок, т.е. от концов гена, до конца одноцепочечной хромосомной молекулы.
Если теперь снова нагреть смесь, то хромосомные и вновь синтезированные цепи разойдутся. После охлаждения к ним снова присоединятся затравки, которые берутся в большом избытке (см. рис. 10).
На вновь синтезированных цепях они присоединятся не к тому концу, с которого начинался первый синтез а к противоположному, так как цепи ДНК антипараллельны. Поэтому во втором цикле синтеза на таких цепях достроится только последовательность, соответствующая гену (см. рис. 11).
В данном методе применяется ДНК-полимераза из термофильных бактерий, способная выдерживать кипячение и работающая при температурах 70-80 о С, её не надо добавлять каждый раз, а достаточно внести в начале опыта. Повторяя процедуры нагрева и охлаждения в той же последовательности, мы можем в каждом цикле удваивать число последовательностей, ограниченных с двух концов внесёнными затравками (см. рис. 12).
После примерно 25 таких циклов число копий гена увеличится более чем в миллион раз. Такие количества легко можно отделить от внесённой в пробирку хромосомной ДНК и использовать для различных целей.
секвенирование ДНК
Ещё одним важным достижением является разработка методов определения последовательности нуклеотидов в ДНК - секвенирования ДНК (от англ. sequence - последовательность). Для этого необходимо получить чистые от других ДНК гены одним из описанных методов. Затем цепи ДНК разделяют нагреванием и прибавляют к ним затравку, меченую радиоактивным фосфором или флуоресцентной меткой. Обратите внимание, что берётся одна затравка, комплементарная одной цепи. Затем добавляется ДНК полимераза и смесь из 4-х нуклеотидов. Такая смесь делится на 4 части и к каждой добавляется один из нуклеотидов, модифицированный так, что у третьего атома дезоксирибозы он не содержит гидроксильной группы. Если такой нуклеотид включится в синтезируемую цепь ДНК, то её удлинение не сможет продолжаться, т.к. полимеразе некуда будет присоединять следующий нуклеотид. Поэтому синтез ДНК после включения такого нуклеотида обрывается. Таких нуклеотидов, называемых дидезоксинуклеотиды, добавляется значительно меньше, чем обычных, поэтому обрыв цепи происходит лишь изредка и в каждой цепи в разных местах. В результате получается смесь цепей разной длины, на конце каждой из них стоит один и тот же нуклеотид. Таким образом длина цепи соответствует номеру нуклеотида в изучаемой последовательности, например, если у нас был адениловый дидезоксинуклеотид, а полученные цепи имели длину 2, 7 и 12 нуклеотидов, значит в гене во второй, седьмой и двенадцатой позиции стоял аденин. Полученную смесь цепей легко разделить по размерам при помощи электрофореза, а синтезированные цепи выявить по радиоактивности на рентгеновской плёнке (см. рис. 10).
Получается картина, приведённая внизу рисунка, называемая радиоавтографом. Двигаясь по нему снизу вверх и читая буква над колонками каждой зоны мы получим последовательность нуклеотидов, приведённую на рисунке справа от автографа. Оказалось, что синтез останавливается не толоко дидезоксинуклеотидами, но и нуклеотидами, у которых в третьем положении сахара присоединяется какая-нибудь химическая группа, например флюоресцентный краситель. Если каждый нуклеотид пометить своим красителем, то зоны, получаемые при разделении синтезированных цепей, будут светиться разным светом. Это позволяет проводить реакцию в одной пробирке одновременно для всех нуклеотидов и разделяя полученные цепи по длине, идентифицировать нуклеотиды по цвету (см. рис. 11).
Такие методы позволили определить последовательности не только отдельных генов, но и прочитать целые геномы. В настоящее время разработаны ещё более быстрые методы определения последовательностей нуклеотидов в генах. Если парвый геном человека был расшифрован большим международным консорциумом с использованием первого приведённого метода за 12 лет, второй, с использованием второго, за три года, то сейчас это может быть сделано за месяц. Это позволяет предсказывать предрасположенность человека к многим заболеваниям и заранее принимать меры, чтобы избежать их.
Комикс на конкурс «био/мол/текст»: Сегодня молекулярный биолог Пробирочка проведет вас по миру удивительной науки - молекулярной биологии! Мы начнем с исторического экскурса по этапам ее развития, опишем главные открытия и эксперименты, начиная с 1933 года. А также наглядно расскажем о главных методах молекулярной биологии, которые позволили манипулировать генами, изменять и выделять их. Появление этих методов послужило сильным толчком в развитии молекулярной биологии. А еще вспомним о роли биотехнологии и затронем одну из популярнейших тем в этой области - редактирование генома с помощью CRISPR/Cas-систем.
Генеральный спонсор конкурса и партнер номинации «Сколтех» - .
Спонсор конкурса - компания «Диаэм» : крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Спонсором приза зрительских симпатий выступила компания .
«Книжный» спонсор конкурса - «Альпина нон-фикшн »
1. Введение. Сущность молекулярной биологии
Изучает основы жизнедеятельности организмов на уровне макромолекул. Целью молекулярной биологии является установление роли и механизмов функционирования этих макромолекул на основе знаний об их структурах и свойствах.
Исторически молекулярная биология сформировалась в ходе развития направлений биохимии, изучающих нуклеиновые кислоты и белки. В то время как биохимия исследует обмен веществ, химический состав живых клеток, организмов и осуществляемые в них химические процессы, молекулярная биология главное внимание сосредоточивает на изучении механизмов передачи, воспроизведения и хранения генетической информации.
А объектом изучения молекулярной биологии являются сами нуклеиновые кислоты - дезоксирибонуклеиновые (ДНК), рибонуклеиновые (РНК) - и белки, а также их макромолекулярные комплексы - хромосомы, рибосомы, мультиферментные системы, обеспечивающие биосинтез белков и нуклеиновых кислот. Молекулярная биология также граничит по объектам исследования и частично совпадает с молекулярной генетикой, вирусологией, биохимией и рядом других смежных биологических наук.
2. Исторический экскурс по этапам развития молекулярной биологии
Как отдельное направление биохимии, молекулярная биология начала развиваться в 30-х годах прошлого века. Еще тогда возникла необходимость понимания феномена жизни на молекулярном уровне для исследований процессов передачи и хранения генетической информации. Как раз в то время установилась задача молекулярной биологии в изучении свойств, структуры и взаимодействия белков и нуклеиновых кислот.
Впервые термин «молекулярная биология» применил в 1933 году Уильям Астбери в ходе исследования фибриллярных белков (коллагена, фибрина крови, сократительных белков мышц). Астбери изучал связь между молекулярной структурой и биологическими, физическими особенностями данных белков. На первых порах возникновения молекулярной биологии РНК считалась составляющей только растений и грибов, а ДНК - только животных. А в 1935 году открытие ДНК гороха Андреем Белозерским привело к установлению факта, что ДНК содержится в каждой живой клетке.
В 1940 году колоссальным достижением стало установление Джорджем Бидлом и Эдуардом Тэйтемом причинно-следственной связи между генами и белками. Гипотеза ученых «Один ген - один фермент» легла в основу концепции о том, что специфичное строение белка регулируется генами. Полагается, что генетическая информация закодирована специальной последовательностью нуклеотидов в ДНК, которая регулирует первичную структуру белков. Позже было доказано, что многие белки имеют четвертичную структуру. В образовании таких структур принимают участие различные пептидные цепи. Исходя из этого, положение о связи между геном и ферментом было несколько преобразовано, и теперь звучит как «Один ген - один полипептид».
В 1944 году американский биолог Освальд Эвери с коллегами (Колином Маклеодом и Маклином Маккарти) доказал, что веществом, вызывающим трансформацию бактерий, является ДНК, а не белки. Эксперимент послужил доказательством роли ДНК в передаче наследственной информации, перечеркнув устаревшие знания о белковой природе генов.
В начале 50-х годов Фредерик Сенгер показал, что белковая цепь - уникальная последовательность аминокислотных остатков. В 1951 и 1952 годах ученый определил полную последовательность двух полипептидных цепей - бычьего инсулина В (30 аминокислотных остатков) и А (21 аминокислотный остаток) соответственно.
Примерно в то же время, в 1951–1953 гг., Эрвин Чаргафф сформулировал правила о соотношении азотистых оснований в ДНК. Согласно правилу, вне зависимости от видовых различий живых организмов в их ДНК количество аденина (A) равно количеству тимина (T), а количество гуанина (G) равно количеству цитозина (C).
В 1953 году доказана генетическая роль ДНК. Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик на основе рентгенограммы ДНК, полученной Розалинд Франклин и Морисом Уилкинсом , установили пространственную структуру ДНК и выдвинули подтвердившееся позднее предположение о механизме ее репликации (удвоении), лежащем в основе наследственности.
1958 год - формирование центральной догмы молекулярной биологии Фрэнсисом Криком: перенос генетической информации идет в направлении ДНК → РНК → белок.
Суть догмы состоит в том, что в клетках имеется определенный направленный поток информации от ДНК, которая, в свою очередь, представляет собой исходный генетический текст, состоящий из четырех букв: A, T, G и C. Он записан в двойной спирали ДНК в виде последовательностей этих букв - нуклеотидов.
Этот текст транскрибируется. А сам процесс называется транскрипцией . В ходе данного процесса происходит синтез РНК, которая является идентичной генетическому тексту, но с отличием: в РНК вместо T стоит U (урацил).
Данная РНК называется информационной РНК (иРНК ), или матричной (мРНК ). Трансляция иРНК осуществляется при помощи генетического кода в виде триплетных последовательностей нуклеотидов. В ходе этого процесса происходит перевод текста нуклеиновых кислот ДНК и РНК из четырехбуквенного текста в двадцатибуквенный текст аминокислот.
Природных аминокислот существует всего двадцать, а букв в тексте нуклеиновых кислот четыре. Из-за этого происходит перевод из четырехбуквенного алфавита в двадцатибуквенный посредством генетического кода, в котором каждым трем нуклеотидам соответствует какая-либо аминокислота. Так можно сделать из четырех букв целые 64 трехбуквенные комбинации, притом что аминокислот 20. Из этого следует, что генетический код обязательно должен иметь свойство вырожденности. Однако в то время генетический код не был известен, к тому же его даже не начали расшифровывать, но Крик уже сформулировал свою центральную догму.
Тем не менее была уверенность в том, что код должен существовать. К тому времени было доказано, что этот код обладает триплетностью. Это означает, что конкретно три буквы в нуклеиновых кислотах (кодóны ) отвечают какой-либо аминокислоте. Этих кодонов всего 64, они кодируют 20 аминокислот. Это означает, что каждой аминокислоте отвечает сразу несколько кодонов.
Таким образом, можно сделать вывод, что центральная догма является постулатом, который гласит о том, что в клетке происходит направленный поток информации: ДНК → РНК → белок. Крик сделал акцент на главном содержании центральной догмы: обратного потока информации происходить не может, белок не способен изменять генетическую информацию.
В этом и заключается основной смысл центральной догмы: белок не в состоянии изменять и преобразовывать информацию в ДНК (или РНК), поток всегда идет лишь в одну сторону.
Спустя время после этого был открыт новый фермент, который не был известен во времена формулировки центральной догмы, - обратная транскриптаза , которая синтезирует ДНК по РНК. Фермент был открыт в вирусах, у которых генетическая информация закодирована в РНК, а не в ДНК. Такие вирусы называют ретровирусами. Они имеют вирусную капсулу с заключенными в нее РНК и специальным ферментом. Фермент и есть обратная транскриптаза, которая синтезирует ДНК по матрице этой вирусной РНК, а эта ДНК потом уже служит генетическим материалом для дальнейшего развития вируса в клетке.
Конечно, данное открытие вызвало большой шок и множество споров среди молекулярных биологов, поскольку считалось, что, исходя из центральной догмы, этого быть не может. Однако Крик сразу объяснил, что он никогда не говорил, что это невозможно. Он говорил лишь то, что никогда не может происходить поток информации от белка к нуклеиновым кислотам, а уже внутри нуклеиновых кислот любого рода процессы вполне возможны: синтез ДНК на ДНК, ДНК на РНК, РНК на ДНК и РНК на РНК.
После формулирования центральной догмы по-прежнему оставался ряд вопросов: как алфавит из четырех нуклеотидов, составляющих ДНК (или РНК), кодирует 20-буквенный алфавит аминокислот, из которых состоят белки? В чем состоит сущность генетического кода?
Первые идеи о существовании генетического кода сформулировали Александр Даунс (1952 г.) и Георгий Гамов (1954 г.). Ученые показали, что последовательность нуклеотидов должна включать в себя не менее трех звеньев. Позднее было доказано, что такая последовательность состоит из трех нуклеотидов, названных кодоном (триплетом ). Тем не менее вопрос о том, какие нуклеотиды ответственны за включение какой аминокислоты в белковую молекулу, оставался открытым до 1961 года.
А в 1961 году Маршалл Ниренберг вместе с Генрих Маттеи использовали систему для трансляции in vitro . В роли матрицы взяли олигонуклеотид. В его состав входили только остатки урацила, а пептид, синтезированный с него, включал только аминокислоту фенилаланин. Таким образом впервые было установлено значение кодона: кодон UUU кодирует фенилаланин. Поле них Хар Корана выяснил, что последовательность нуклеотидов UCUCUCUCUCUC кодирует набор аминокислот серин-лейцин-серин-лейцин. По большому счету, благодаря работам Ниренберга и Кораны, к 1965 году генетический код был полностью разгадан. Выяснилось, что каждый триплет кодирует определенную аминокислоту. А порядок кодонов определяет порядок аминокислот в белке.
Главные принципы функционирования белков и нуклеиновых кислот сформулировали к началу 70-х годов. Было зафиксировано, что синтез белков и нуклеиновых кислот осуществляется по матричному механизму. Молекула-матрица несет закодированную информацию о последовательности аминокислот или нуклеотидов. При репликации или транскрипции матрицей служит ДНК, при трансляции и обратной транскрипции - иРНК.
Так были созданы предпосылки для формирования направлений молекулярной биологии, в том числе и генной инженерии. А в 1972 году Пол Берг с коллегами разработал технологию молекулярного клонирования. Ученые получили первую рекомбинантную ДНК in vitro . Эти выдающиеся открытия легли в основу нового направления молекулярной биологии, а 1972 год с тех пор считается датой рождения генной инженерии.
3. Методы молекулярной биологии
Колоссальные успехи в изучении нуклеиновых кислот, строении ДНК и биосинтеза белка привели к созданию ряда методов, имеющих большое значение в медицине, сельском хозяйстве и науке в целом.
После изучения генетического кода и основных принципов хранения, передачи и реализации наследственной информации для дальнейшего развития молекулярной биологии стали необходимы специальные методы. Эти методы позволили бы проводить манипуляции с генами, изменять и выделять их.
Появление таких методов произошло в 1970–1980-х годах. Это дало огромный толчок развитию молекулярной биологии. В первую очередь, эти методы напрямую связаны с получением генов и их внедрением в клетки других организмов, а еще с возможностью определения последовательности нуклеотидов в генах.
3.1. Электрофорез ДНК
Электрофорез ДНК является базовым методом работы с ДНК. Электрофорез ДНК применяется вместе почти со всеми остальными методами для выделения нужных молекул и дальнейшего анализа результатов. Сам метод электрофореза в геле используется для разделения фрагментов ДНК по длине.
Предварительно или после электрофореза гель обрабатывается красителями, которые способны связаться с ДНК. Красители флуоресцируют в ультрафиолетовом свете, получается картина из полос в геле. Для определения длин фрагментов ДНК их можно сравнить с мáркерами - наборами фрагментов стандартных длин, которые наносятся на тот же гель.
Флуоресцентные белки
При исследовании эукариотических организмов в качестве генов-мáркеров сподручно использовать флуоресцентные белки. Ген первого зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP ) выделили из медузы Aqeuorea victoria , после чего внедрили в различные организмы. После выделяли гены флуоресцентных белков других цветов: синих, желтых, красных. Чтобы получить белки с интересующими свойствами, такие гены были модифицированы искусственно.
Вообще, важнейшими инструментами для работы с молекулой ДНК являются ферменты, осуществляющие ряд превращений ДНК в клетках: ДНК-полимеразы , ДНК-лигазы и рестриктазы (рестрикционные эндонуклеазы ).
Трансгенез
Трансгенезом называется перенос генов из одного организма в другой. А такие организмы называются трансгенными .
Рекомбинантные белковые препараты как раз получают методом переноса генов в клетки микроорганизмов. В основном такими белковыми препаратами являются интерфероны , инсулин , некоторые белковые гормоны, а также белки для производства ряда вакцин.
В иных случаях применяют клеточные культуры эукариот или трансгенных животных, по большей степени, скот, который выделяет нужные белки в молоко. Таким образом получают антитела, факторы свертывания крови и другие белки. Метод трансгенеза используют для получения культурных растений, устойчивых к вредителям и гербицидам, а при помощи трансгенных микроорганизмов очищают сточные воды.
Помимо всего перечисленного, трансгенные технологии незаменимы в научных исследованиях, ведь развитие биологии происходит быстрее с применением методов модификации и переноса генов.
Рестриктазы
Распознаваемые рестриктазами последовательности являются симметричными, поэтому всякого рода разрывы могут происходить либо в середине такой последовательности, либо со сдвигом в одной или обеих нитях молекулы ДНК.
При расщеплении любой ДНК рестриктазой, последовательности на концах фрагментов будут одинаковыми. Они смогут снова соединяться, поскольку имеют комплементарные участки.
Получить единую молекулу можно, сшив данные последовательности при помощи ДНК-лигазы . За счет этого возможно объединять фрагменты двух разных ДНК и получать рекомбинантные ДНК.
3.2. ПЦР
В основе метода лежит способность ДНК-полимераз достраивать вторую нить ДНК по комплементарной нити так же, как при процессе репликации ДНК в клетке.
3.3. Секвенирование ДНК
Стремительное развитие метода секвенирования позволяет эффективно определять особенности исследуемого организма на уровне его генома. Главным преимуществом таких геномных и постгеномных технологий является увеличение возможностей исследования и изучения генетической природы заболеваний человека, для того чтобы заранее принять необходимые меры и избежать болезней.
За счет крупных исследований возможно получать необходимые данные о различных генетических характеристиках разных групп людей, тем самым развивая методы медицины. Из-за этого выявление генетической расположенности к различным заболеваниям сегодня пользуется огромной популярностью.
Подобные методы широко применимы практически во всем мире, в том числе и в России. Из-за научного прогресса происходит внедрение таких методов в медицинские исследования и медицинскую практику в целом.
4. Биотехнология
Биотехнология - дисциплина, изучающая возможности использования живых организмов или их систем для решения технологических задач, а еще создания живых организмов с нужными свойствами путем генной инженерии. Биотехнология применяет методы химии, микробиологии, биохимии и, конечно же, молекулярной биологии.
Основные направления развития биотехнологии (принципы биотехнологических процессов внедряют в производство всех отраслей):
- Создание и производство новых видов продуктов питания и кормов для животных.
- Получение и изучение новых штаммов микроорганизмов.
- Выведение новых сортов растений, а также создание средств для защиты растений от болезней и вредителей.
- Применение методов биотехнологии для нужд экологии. Такие методы биотехнологии используют для переработки утилизации отходов, очистки сточных вод, отработанного воздуха и санации почв.
- Изготовление витаминов, гормонов, ферментов, сывороток для нужд медицины. Биотехнологи разрабатывают усовершенствованные лекарственные препараты, которые ранее считались неизлечимыми.
Крупным достижением биотехнологии является генная инженерия.
Генная инженерия - совокупность технологий и методов получения рекомбинантных молекул РНК и ДНК, выделения отдельных генов из клеток, осуществление манипуляций с генами и введение их в другие организмы (бактерий, дрожжи, млекопитающих). Такие организмы способны производить конечные продукты с нужными, измененными свойствами.
Методы генной инженерии направлены на конструирование новых, ранее не существовавших сочетаний генов в природе.
Говоря о достижениях генной инженерии, невозможно не затронуть тему клонирования. Клонирование - это один из методов биотехнологии, применяемый для получения идентичных потомков различных организмов при помощи бесполого размножения.
Иными словами, клонирование можно представить как процесс создания генетически идентичных копий организма или клетки. А клонированные организмы похожи или вовсе идентичны не только по внешним признакам, но и по генетическому содержанию.
Небезызвестная овечка Долли в 1966 году стала первым клонированным млекопитающим. Она была получена за счет пересадки ядра соматической клетки в цитоплазму яйцеклетки. Долли являлась генетической копией овцы-донора ядра клетки. В естественных условиях особь формируется из одной оплодотворенной яйцеклетки, получив по половине генетического материала от двух родителей. Однако при клонировании генетический материал взяли из клетки одной особи. Сначала из зиготы удалили ядро, в котором находится сама ДНК. После чего извлекли ядро из клетки взрослой особи овцы и имплантировали его в ту лишенную ядра зиготу, а затем ее пересадили в матку взрослой особи и предоставили возможность для роста и развития.
Тем не менее не все попытки клонирования оказывались удачными. Параллельно с клонированием Долли эксперимент по замене ДНК был проведен на 273 других яйцеклетках. Но только в одном случае смогло полноценно развиться и вырасти живое взрослое животное. После Долли ученые пробовали клонировать и другие виды млекопитающих.
Одним их видов генной инженерии является редактирование генома.
Инструмент CRISPR/Cas базируется на элементе иммунной защитной системы бактерий, который ученые приспособили для внедрения каких-либо изменений в ДНК животных или растений.
CRISPR/Cas является одним из биотехнологических методов манипулирования отдельными генами в клетках. Существует огромное множество применений такой технологии. CRISPR/Cas позволяет исследователям выяснять функцию разных генов. Для этого нужно просто вырезать исследуемый ген из ДНК и изучить, какие функции организма были затронуты.
Некоторые практические применения системы:
- Сельское хозяйство. За счет CRISPR/Cas-систем можно усовершенствовать сельскохозяйственные культуры. А именно, сделать их более вкусными и питательными, а также устойчивыми к жаре. Возможно наделить растения и другими свойствами: к примеру, вырезать из орехов (арахиса или фундука) ген аллергена.
- Медицина, наследственные заболевания. У ученых есть цель применять CRISPR/Cas для удаления из человеческого генома мутаций, из-за которых могут развиваться заболевания, такие, как серповидноклеточная анемия и др. В теории, за счет CRISPR/Cas можно останавливать развитие ВИЧ.
- Генный драйв. CRISPR/Cas может изменять не только геном отдельного животного или растения, но также и генофонд вида. Данная концепция известна как «генный драйв » . Всякий живой организм передает своему потомству половину генов. Но использование CRISPR/Cas может повышать вероятность передачи генов до 100%. Это важно для того, чтобы нужный признак быстрее распространился во всей популяции.
Швейцарские ученые значительно усовершенствовали и модернизировали метод редактирования генома CRISPR/Cas, тем самым расширив его возможности. Тем не менее ученые могли модифицировать только один ген за раз, используя CRISPR/Cas-систему. Но сейчас исследователи Швейцарской высшей технической школы Цюриха разработали метод, с помощью которого возможно одновременно модифицировать 25 генов в клетке.
Для новейшей методики специалисты использовали фермент Cas12a . Генетики впервые в истории успешно клонировали обезьян . «Популярная механика» ;
Молекулярная биология / м ə л ɛ к J ʊ л ər / является ветвью биологии , что касается молекулярной основы биологической активности между биомолекул в различных системах клетки , в том числе взаимодействий между ДНК , РНК , белков и их биосинтеза , а также регулирование этих взаимодействий. Запись в природе в 1961 году, Астбери описал молекулярную биологию:
Не столько техника, как подход, подход с точки зрения так называемых фундаментальных наук с ведущей идеей поиска ниже крупномасштабных проявлений классической биологии для соответствующего молекулярного плана. Он обеспокоен тем, в частности, с формами биологических молекул и [...] преимущественно трехмерным и структурно - что не означает, однако, что это всего лишь уточнение морфологии. Он должен в то же время исследовать генезис и функции.
Отношение к другим биологическим наукам
Исследователи в области молекулярной биологии используют специфические методы произрастающих молекулярной биологии, но все больше и больше комбинировать их с методами и идеями от генетики и биохимии . Существует не определенная грань между этими дисциплинами. Это показано на следующей схеме, которая изображает один возможный вид отношений между полями:
- Биохимия является изучение химических веществ и жизненно важных процессовпроисходящих в живых организмах . Биохимики тяжело сосредоточиться на роли, функции и структуры биомолекул . Изучение химии за биологических процессов и синтеза биологически активных молекулявляются примерами биохимии .
- Генетика является изучение влияния генетических различий в организмах. Это часто может быть выведенотсутствии нормальной компоненты (напримеродин ген). Изучение « мутанты » - организмыкоторыеимеют один или более функциональные компоненты по отношению к так называемому « дикому типу » или нормальному фенотипу . Генетические взаимодействия ( эпистаз) часто путают простые интерпретации таких « нокаут » исследования.
- Молекулярная биология является изучение молекулярных основ процессов репликации , транскрипции , трансляции и функции клеток. Центральная догма молекулярной биологии , где генетический материал транскрибируется в РНК и затем транслируется в белок , несмотрятоупрощенно,прежнему обеспечивает хорошую начальную точку для понимания поля. Картина была пересмотрена в свете возникающих новых ролей для РНК .
Методы молекулярной биологии
Молекулярное клонирование
Одним из самых основных методов молекулярной биологии для изучения функции белка является молекулярным клонированием . В этой технике, ДНК, кодирующий белок, представляющего интерес, клонированной с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), и / или ферменты рестрикции в плазмиде (вектора экспрессии ,). Вектор имеет 3 отличительные особенности: начало репликации, а сайт множественного клонирования (MCS), и селективный маркер, как правило, с устойчивостью к антибиотикам . Расположенные выше сайт множественного клонирования являются промоторными областями и транскрипции сайта инициации, которые регулируют экспрессию клонированного гена. Эта плазмида может быть вставлена в либо бактериальные или животных клеток. Введение ДНК в бактериальные клетки может быть сделано путем трансформации с помощью поглощения голой ДНК, конъюгаций с помощью межклеточных контактов или путем трансдукции с помощью вирусного вектора. Введение ДНК в эукариотические клетки, такие как клетки животных, с помощью физических или химических средств, называется трансфекцией . Несколько различных методов трансфекции доступны, такие как фосфат кальция трансфекции, электропорации , микроинъекции и липосомальной трансфекции . Плазмида может быть интегрирована в геном , что приводит к стабильной трансфекции, или может оставаться независимыми от генома, называемого переходными процессы трансфекции.
ДНК, кодирующие белки, представляющего интереса, в настоящее время внутри клетки, и белки , теперь могут быть выражены. Разнообразные системы, такие как индуцибельные промоторы и специфических клеточных сигнальных факторов, которые помогут выразить интерес белок на высоких уровнях. Большие количества белка могут быть затем извлечены из бактериальной или эукариотической клетки. Белок может быть проверен на ферментативную активность при различных ситуациях, белка можно кристаллизовать поэтому его третичная структура может быть изучена, или, в фармацевтической промышленности, активность новых препаратов против белка может быть изучена.
Полимеразной цепной реакции
Макромолекулы-блоттинга и исследование
Термины северный , западный и восточный блоттинг получает из, что первоначально была молекулярная биология шутка, которая играла на термине Саузернет , после методики, описанной Edwin Southern для гибридизации BLOTTED ДНК. Патриция Томас, разработчик РНК - блоттинга, который затем стал известен как северному - блоттинга , на самом деле не использовать этот термин.
Саузернблоттинг
Названный в честь его изобретателя, биолог Эдвин Южный , то Саузерн - блот представляет собой метод для исследования на наличие специфической последовательности ДНК в образце ДНК. Образцы ДНК до или после фермента рестрикции (рестриктаз) перевариваний разделены с помощью электрофореза в геле, а затем переносили на мембрану с помощью блоттинга с помощью капиллярного действия . Мембрану затем подвергают воздействию меченого ДНК - зонда, который имеет последовательность оснований дополнением к последовательности на ДНК, представляющей интерес. Саузерн - блоттинг менее широко используется в научной лаборатории из - за способности других методов, таких как ПЦР , для обнаружения специфических последовательностей ДНК из образцов ДНК. Эти блоты все еще используются для некоторых применений, однако, таких как измерение трансгена числа копий в трансгенных мышах или в инженерии гена нокаутных линий эмбриональных стволовых клеток .
Северный блоттинга
Northern блот диаграмма
Восточно-блоттинга
Клинические исследования и медицинские методы лечения, вытекающие из молекулярной биологии, частично охвачены генной терапии . Применение молекулярной биологии или молекулярных клеточная биология подходов в медицине теперь называется молекулярной медициной . Молекулярная биология также играет важную роль в понимании образования, действий и нормативных актов различных частей клеток , которые могут быть использованы для эффективных предназначаться новые лекарства , болезнь диагноза и понять физиологию клетки.
дальнейшее чтение
- Cohen, SN, Чанг, НКД, Бойер, H. & Heling, RB Конструирование биологически функциональных бактериальных плазмид в пробирке
.
